曲妥珠单抗与顺铂序贯联合应用对乳腺癌细胞抑制作用的研究

吴志勇，孙胜杰，焦顺昌（解放军总医院肿瘤内科， 北京 100853）

HER-2（human epidermal growth factor receptors-2）基因的过度表达是乳腺癌的重要预后不良因素。曲妥珠单抗（赫赛汀，trastuzumab）是以HER-2/neu蛋白为靶点设计的人源化单克隆抗体。大量研究表明，曲妥珠单抗可明显提高化疗对HER-2/neu过度表达乳腺癌的疗效，并可广泛应用于治疗的各个阶段[1]。但是在联合治疗方案中，曲妥珠单抗的使用最佳时机仍有待明确，因此，我们设计了关于曲妥珠单抗联合化疗序贯方式研究的系列实验，已报道的曲妥珠单抗与多西他赛、吉西他滨的序贯联合应用的结果，与临床应用情况基本吻合[2-4]。本文旨在寻找曲妥珠单抗与顺铂联合应用的最佳序贯方式，并初步探讨其机制，从而为临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品和试剂 MI/1640培养液（美国GIBCO公司）；胎牛血清（北京元亨圣马生物技术研究所）；MTT（美国AMRESCO公司）；顺铂（齐鲁制药）；曲妥珠单抗（上海罗氏制药）。

1.1.2 主要设备 二氧化碳孵箱（美国Baxter）；96孔板（美国COSTOR3599）；酶标仪（上海雷勃分析仪器有限公司，型号：Multiskan MK3353）；YKH2 Ⅱ型液体快速混合器（江西医疗器械厂）。

1.2 方法

人乳腺癌细胞珠MDA-MB453其Her-2/neu基因扩增为阳性，由解放军总医院肿瘤内科提供，用细胞计数板计数活细胞数。

1.2.1 MTT 法测定药物作用抑制率 将2.0×104个细胞接种于96 孔板（200 μL/孔），培养24 h；将药物按照不同浓度加入，共培养60 h；加入5% MTT 20 μL/孔，4 h后加入DMSO 200 μL/孔，振荡；用酶标仪（波长492 nm） 测定OD 值，最后结果取均值，以未处理组作为对照组，按下列公式计算各组的抑制率:抑制率（%） = 1– （实验组OD492/ 对照组OD492）×100 %。

1.2.2 MTT法测定顺铂与曲妥珠单抗以不同序贯方式联合应用的抑制率 分别设立DDP前24 h应用HER组、DDP前18 h应用HER组、DDP前12 h应用HER组、DDP前6 h应用HER组、DDP+HER同时作用组、DDP后6 h应用HER组、DDP后12 h应用HER组、DDP后18 h应用HER组、DDP后24 h应用HER组序贯结合方式。将顺铂与曲妥珠单抗加入孔中。顺铂加入后培养60 h，MTT法测定各组的OD值，重复操作3次，取平均值，计算出实验组抑制率。

利用以下金氏公式计算参数Q判断两药的合并用药效应：

其中，Ea代表HER的抑制率，Eb代表DDP的抑制率，E（a+b）为两药联合应用的抑制率，即实测合并效应，分母 Ea+ Eb– Ea*Eb为期望合并效应，Q 为两者相比。Q 值在 0.85 ～ 1.15 时，合并效应为相加作用，Q值＞ 1.15为协同作用，Q 值＜ 0.85 为拮抗作用[5]。

流式细胞仪分析DDP与HER以不同序贯方式联合对MDA-MB453细胞细胞周期的影响。

1.3 统计学分析

采用SPSS10.0统计软件，单因素方差分析比较各组，数据以（±s） 表示，P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 法测定药物作用于MDA-MB453 细胞抑制率

通过计算得出DDP 30%抑制率浓度约为29.17 μg·mL-1。HER 15%抑制率约为7.19 μg·mL-1。

2.2 MTT 法测定各实验组抑制率及Q值

结果见表1。结果表明两药联合应用时效果均好于单药DDP组的抑制率（30.98%，P ＜ 0.01）；其中两药同时应用组及加入DDP后应用HER组联合抑制率明显高于在DDP前应用HER组，Q值提示各组均为相加作用，其中以两药同时使用时相加作用效果最好（Q = 1.106）。

表1 不同序贯方式顺铂与曲妥珠单抗联合对乳腺癌细胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

表1 不同序贯方式顺铂与曲妥珠单抗联合对乳腺癌细胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

注：联合作用组抑制率与单药DDP抑制率间差异具有统计学意义, *P ＜ 0.01；两药同时应用组Q值与其他组Q值间差异具有统计学意义，**P ＜ 0.01Note：the difference of inhibition ratio between HER+DDP and DDP was statistically significant, *P ＜ 0.01; Q-value difference between simultaneously combined group and other groups was statistically significant, **P ＜ 0.01

组别 HER抑制率/% HER + DDP抑制率/% Q值单药DDP – 30.98±1.537 –加入DDP前24 h应用HER 15.83±0.095 36.57±1.141* 0.872±0.012加入DDP前18 h应用HER 17.58±0.291 39.71±1.192* 0.921±0.021加入DDP前12 h应用HER 16.44±0.863 39.39±1.204* 0.930±0.062加入DDP前 6 h应用HER 14.03±0.778 41.42±3.196* 1.018±0.055 DDP + HER同时应用 20.46±1.298 49.88±1.531* 1.106±0.071**加入DDP后 6 h应用HER 28.23±1.462 47.03±0.988* 0.932±0.060加入DDP后12 h应用HER 26.61±1.353 48.04±1.386* 0.973±0.047加入DDP后18 h应用HER 28.23±2.904 49.91±1.798* 0.988±0.103加入DDP后24 h应用HER 28.71±2.481 50.80±1.675* 1.000±0.094

2.3 流式细胞仪分析顺铂与曲妥珠单抗以不同序贯方式联合应用对细胞周期的影响

结果见表2。结果表明，与单药DDP化疗组相比，DDP前应用HER组G0/G1、S期细胞所占比例减少，G2/M期细胞增多，而其他组则未见明显变化，提示此组中两药的相加作用较弱与细胞周期的影响有关。

3 讨论

实验结果显示：曲妥珠单抗与顺铂联合应用抑制作用强于单药顺铂，其机制在于：HER-2过度表达可降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，联合使用曲妥珠单抗可引起HER-2蛋白的内化，而减少表达，从而提高肿瘤细胞化疗敏感性，而取得较好的抑制率[6-7]。此外，顺铂作用于细胞DNA引起损伤的启动自身保护机制─非常规DNA合成进行DNA修复，Pietras RJ等[8]证明顺铂联合使用曲妥珠单抗可明显减少顺铂引起的非常规DNA合成，从而取得较好的治疗效果。

表2 乳腺癌细胞经曲妥珠单抗与顺铂处理后各细胞周期的变化.%，n = 3，±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

表2 乳腺癌细胞经曲妥珠单抗与顺铂处理后各细胞周期的变化.%，n = 3，±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

注：联合作用组细胞周期与单药DDP进行单因素方差分析,*P ＜ 0.01Note: one-factor analysis of variance of cell cycle between combined treatment group and DDP group, *P ＜ 0.01

组别 G0/G1 S G2/M对照组 56.27±0.87 30.69±1.43 13.04±0.65单药DDP 51.85±2.52 26.09±2.11 22.05±0.72单药HER 65.32±2.32 24.11±1.73 10.57±2.15加入DDP前12 h应用HER 30.94±2.01* 21.64±1.34* 47.42±3.38*DDP+HER同时应用 49.60±1.37 24.79±1.93 25.61±2.82加入DDP后6 h应用HER 53.89±2.04 24.61±1.45 21.50±0.93

在两药不同序贯方式联合应用的对比中发现，顺铂前应用曲妥珠单抗效果较差。可能因为顺铂主要针对增殖活跃的细胞，而先使用曲妥珠单抗会使肿瘤细胞停止在G0/G1期而降低了肿瘤细胞的增殖活性，所以也在一定程度上降低了对细胞毒药物的敏感性。细胞周期结果显示：与单药顺铂比较，先应用曲妥珠单抗后应用顺铂组出现了明显的S、G2/M期阻滞，但对肿瘤细胞的抑制作用却没有明显增高。可能是因为应用曲妥珠单抗后激活了一些通路增加S、G2/M期细胞周期检测点而增强了细胞DNA修复[9]，降低了两药联合的抑制作用。

本实验再次证实了曲妥珠单抗与顺铂对于肿瘤细胞的生长抑制作用及对细胞周期的影响。并得出了两药不同序贯方式联合使用时，均表现为相加作用，其中同时应用时效果最好，并利用流式细胞技术初步证明这种差异同细胞周期的变化有一定的关系。本次实验为进一步的临床应用及研究提供实验依据，但是不同的个体、细胞系及亚群是否具有相同规律，是否还涉及到其他机制，还有待进一步的基础及临床研究。