HPLC法测定3种杂交翠菊花色苷的含量

陈亮，李公斌，辛秀兰，袁其朋

（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；2.淄博职业学院，山东 淄博 255314；3.北京电子科技职业学院，北京 100029）

HPLC法测定3种杂交翠菊花色苷的含量

陈亮1，3，李公斌2，辛秀兰3，袁其朋1，*

（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；2.淄博职业学院，山东 淄博 255314；3.北京电子科技职业学院，北京 100029）

采用高效液相色谱法（HPLC）对3种不同颜色的杂交翠菊花色苷含量进行测定。使用1%盐酸甲醇溶液分别对3种不同颜色翠菊花色苷进行提取,以矢车菊-3-O-葡萄糖苷为对照品,使用Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-5%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,流速为1 mL/min，检测波长为520 nm。结果表明，粉红色、紫红色、蓝紫色3种杂交翠菊花色苷含量分别为168.15、614.89、193.89 mg/100 g，紫红色杂交翠菊具有较好的应用开发价值。

翠菊；花色苷；高效液相色谱法

翠菊[Callistephus chinensis（Linn.）Nees]属于菊科（Compositae）翠菊属（Callistephus）的单型种，一年生草本植物、浅根性、茎直立、多分枝、叶互生、头状花序、舌状花。生长于山坡抛荒地、山坡草丛、水边或疏林荫处。主产于我国吉林、辽宁、河北、山西、山东、云南及四川等省。翠菊是重要的露地绿化用花卉，同时也是重要的盆栽观赏花卉[1]。

翠菊色彩丰富艳丽，有紫红、桃红、蓝紫等色,尤其是2000年刘振廷先生发现翠菊雄性不育株，并在世界上首先培育出翠菊的杂交品种，翠菊的颜色愈发的多样化，且易于人工控制，为翠菊市场的开拓与发展提供了有效的途径。同时，花色的不同，其所含的天然水溶性色素花色苷成分的种类和含量亦有很大的不同，目前天然食用色素因其良好的安全性、天然着色效果以及抗氧化、抗衰老、抗突变等优良生理活性[2-3]，颇受人们青睐，而人工合成色素日益暴露出诸多弊病，因此，研究开发翠菊花色苷具有很重要的发展应用前景。

目前，测定花色苷的含量主要有pH示差法、直接测定法和HPLC法，pH示差法是传统的、经典的、无需对照品的测定方法。而直接测定法和HPLC法需要对照品，且对照品不易获得、较为昂贵，一度限制了方法的广泛应用，但是HPLC法可以获得更多的样品信息，除了可以测定总的花色苷含量，还可根据色谱峰的个数推断花色苷种类的数量以及相对含量，能够更为直观、快速、简便的了解样品，同时也为翠菊品种的质量控制（如：采收期、品种、储藏、加工等）提供了有效的借鉴[4-6]。

对3种不同颜色杂交翠菊花色苷的提取及测定进行了研究，为其开发利用提供科学参考。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

Agilent-1100高效液相色谱仪（DAD）：美国安捷伦公司；冷冻高速离心机：Sigma 3K15；HZQ-Q振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 主要材料

新鲜盛花期杂交翠菊（Callistephus chinensis表观颜色：Ⅰ粉红色；Ⅱ紫红色；Ⅲ蓝紫色）：湖北富程生物技术有限公司提供；花色苷对照品（矢车菊-3-O-葡萄糖苷，纯度>98%）：成都曼思特生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

色谱柱：ZorbaxSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：溶剂A为甲醇；溶剂B为5%甲酸水溶液；梯度洗脱条件：0～10 min，5%～24%甲醇（A）；10 min～15 min，24%；15 min～30 min，24%～35%；30 min～35 min，35%；35 min～50 min，35%～50%；流速：1.0 mL/min；检测波长520 nm；扫描波长：260 nm～600 nm；柱温30℃。

2.2 标准品溶液的制备及线性关系考察

精确称取矢车菊-3-O-葡萄糖苷对照品10 mg溶于10 mL 1%盐酸甲醇溶液，进样0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μL，各重复进样3次，计算3次平均峰面积。将峰面积Y与进样量X进行直线回归分析，对照品在0～6.4 μg范围内有良好的线性关系，回归方程为：Y=1561.1X-7.3，相关系数 R2=0.9998，见图 1。

图1 对照品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC of the standard(cyn-3-O-glu)

2.3 样品的制备

称取3种不同颜色样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，捣碎，分别溶于1%（体积比）HCl甲醇溶液中，振荡器低速低温振荡提取2 h，静置过夜，7000 r/min高速离心10 min，残渣再另加提取溶剂，振荡浸提离心洗涤至无色，合并3次上清液，分别定容至25 mL，备用。

2.4 精密度试验

吸取一定量矢车菊-3-O-葡萄糖苷溶液，连续进样5次，测定峰面积。测得RSD为1.27%，表明进样精密度良好。

2.5 稳定性试验

吸取一定量矢车菊-3-O-葡萄糖苷溶液，隔4 h进样测5次，测定峰面积。测得RSD为1.46%，表明方法的稳定性良好。

2.6 样品花色苷含量的测定

取1mL提取液，过0.45 μm滤膜后吸取一定量续滤液进样，测定峰面积，按照色谱条件进行测定并根据外标法计算出花色苷的总含量，见表1。

表1 3种不同颜色翠菊花色苷含量Table 1 The anthocyanin content of three hybrid callistephus chinensis with different colors

由测定峰面积及公式计算出3种不同颜色翠菊的花色苷含量，此外，通过3次重复试验，表明试验的重现性良好。

2.7 回收率试验

取3种不同颜色样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3份，精密吸取矢车菊-3-O-葡萄糖苷对照品溶液1 mL，按照2.3的步骤制样，测定峰面积。结果表明：对照品的平均回收率分别为98.37%、96.85%、99.01%，RSD分别为2.33%、2.26%、2.51%，由此建立了HPLC测定翠菊花色苷含量的方法，此方法快速、简便、可靠。

3 结论

3.1 HPLC测定方法的探讨

运用HPLC法测定总花色苷的含量应注意几点问题：1.选择合适的色谱条件，色谱条件应最大限度的使各个色谱峰实现基线的分离，色谱峰的重叠将导致总花色苷的含量降低；2.选择合适的色谱柱，一般的色谱柱测定的pH范围在2～8，SB-C18色谱柱的pH范围在1～9，可以有效地避免5%的甲酸水溶液对色谱柱的损害；3.保证对照品和供试品的测定条件相同，如pH、温度，在不同的pH下，花色苷的最大吸收波长和峰面积会发生变化；4.花色苷提取液经过树脂纯化将会导致花色苷含量不同程度的降低；5.根据不同的标准品计算的总花色苷结果会有差异。

3.2 杂交翠菊花色苷的研究开发意义

杂交翠菊生态适应性和传统翠菊无异，栽培要求条件不高，我国北方大部分地区均可种植，其亩产量可达2000 kg，本文通过对HPLC测定发现紫红色杂交翠菊花色苷含量较高，为614.89 mg/100 g鲜重，对开发高产、高效、高附加值的天然色素具有重要的意义，因此，研究杂交翠菊天然色素具有广阔的前景和重要的意义。

[1]傅壮.中国农业百科全书:观赏园艺卷[M].北京:中国农业出版社,1996:347

[2]Bridle P,Timberlake C F.Anthocyanins as natural food coloursselected aspects[J].Food chemistry,1997,58(2):103-109

[3]Juan Carlos Espin,Cristina Soler-Rivas,Harry J Wichers,et al.Anthocyanin-based natural colorants:A new source of antiradical activity for foodstuff[J].J Agric Food Chem,2000,48(5):1588-1592

[4]Jungmin Lee,Christopher Rennaker,Ronald E Wrolstad.Correlation of two anthocyanin quantification methods:HPLC and spectrophotometric methods[J].Food chemistry,2008,110(3):782-786

[5]Luigi Mondello,Antonella Cotroneo,Giacinto Errante,et al.Determination of anthocyanins in blood orange juices by HPLC analysis[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2000,23(1):191-195

[6]Xianli Wu,Ronald L Prior.Systemaic identification and characterization of anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States:fruits and berries[J].J Agric Food Chem,2005,53(7):2589-2599

Determination of Anthocyanin Content in Hybrid Callistephus Chinensis by HPLC

CHEN Liang1,3,LI Gong-bin2,XIN Xiu-lan3,YUAN Qi-peng1,*
（1.College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China;2.Zibo Vocational College,Zibo 255314,Shandong,China;3.Beijing Vocational College of Electronic Science,Beijing 100029,China）

To determine the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis with different colors.The sample was extracted with methanol of 1%HCl,the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis has been detected by HPLC using cyanidin-3-O-glucoside(cy-3-O-glu)as standard.The analysis was carried on Zorbax SB-C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase was methanol-5%formic acidwater at the flow rate of 1 mL/min,the detection wavelength was 520 nm.Results and conclusion were that the anthocyaninscontentsinthreecallistephuschinensiswithpink,purpleandblue-violetcolorswere168.15mg/100g,614.89 mg/100 g and 193.89 mg/100 g,respectively.It was valuable to exploit the hybrid callistephus chinensis with purple color.

hybrid callistephus chinensis;anthocyanin;HPLC

北京市属高等学校人才强教深化计划资助项目；山东省高等学校优秀青年教师国内访问学者项目；科研基地-生物技术在制药和农产品加工中的应用平台建设（PXM2010_014306_109857）

陈亮（1986—），男（汉），博士研究生，研究方向：天然产物分离。

*通信作者

2011-12-14