β－防御素与牙周健康

石 雪 综述;丁 一 审校

(四川大学华西口腔医学院，四川成都 610041)

口腔中存在着数百种微生物，口腔上皮组织暴露其中，很多人的牙周组织却仍能保持健康，其原因不仅是口腔上皮所具有的物理屏障作用，口腔环境内的抗菌肽(AMPs)所产生的天然免疫反应也起到重要的作用［1－2］。AMPs是一类小分子多肽，分子量3500 ～6500［1］，广谱抗菌，对 G+、G－细菌及真菌和病毒等具有抑制作用［3］，其中防御素是其主要成员之一，含有6个半胱氨酸残基和3对二硫键，根据半胱氨酸残基位置和二硫键的链接方式可分为α－防御素和β－防御素(human beta defensin，HBD)两类，前者来源于小肠和中性粒细胞，后者来源于上皮细胞。两者的分布、表达方式及作用均不相同。本文就β－防御素在牙周病发生、发展过程中的作用及研究现状作一综述。

1 β－防御素的概况

HBD是人类主要的AMPs之一，具有二硫键链接的β折叠结构，其基因簇定位于第8条染色体的P22～23区间，Bensch(1995)首次从肾衰竭病人血透析液中分离出第一类人类β－防御素(HBD－1)至今此家族成员已有6个。其中可在牙周组织中表达的为 HBD－1、HBD－2和 HBD－3，后两者有高度同源性。HBD－1分布于唾液腺导管、胰腺腺泡、阴道等上皮细胞及牙龈组织、颊舌黏膜中，成组成性表达，不受炎症因子水平的影响;HBD－2、HBD－3主要分布于包皮、呼吸道、牙龈组织、颊舌黏膜及皮肤，成诱导性表达，其表达可受炎症因子 IL－1、TNF－α、及细菌等的调控;HBD－4 主要在睾丸、胃窦表达;HBD－5仅在睾丸和附睾表达;HBD－6主要在睾丸和附睾表达，在肺、气管浆液性细胞与非杯状细胞中也有表达。

2 β－防御素与牙周健康的关系

2.1 β－防御素在牙周组织的分布

不同状态的牙龈组织中均可有HBDmRNA和蛋白的表达，在健康牙龈组织，HBD－1与HBD－2的蛋白主要分布于棘层上部、颗粒层以及角化层，HBD－3的蛋白则主要分布于基底细胞层;在炎症牙龈组织，HBD－1、HBD－2蛋白的分布与健康时基本相同，而HBD－3蛋白则不仅分布于基底细胞层还可在棘层大量检出［4］。此外，口腔上皮组织中的HBD只能在已表达外皮蛋白的细胞中检出，而外皮蛋白是角蛋白细胞分化的早期标志［5－6］，结合上皮虽然是牙周炎症的常见始发部位，但其中不含有分化的角蛋白细胞，因此并不能检测到HBD［7］。说明HBD的表达与口腔角蛋白细胞是否分化密切相关。

2.2 炎症牙龈组织中β－防御素的表达

研究表明，在健康牙龈组织中HBD的表达水平高于炎症组织，Dunsche等［8］使用RT－PCR 技术检测 HBD－1、HBD－2、HBD－3mRNA 在健康牙龈及炎症牙龈组织中的检出率，发现HBDmRNA广泛分布于健康牙龈组织，三者的检出率分别为100%、84%、95%;而在炎症牙龈组织中，三者的检出率分别为58%、55%、60%，国内学者研究结果与之相似［9］。此外，不同类型的牙周炎症，HBD的表达亦有差别，Vardar－Sengul S 等［10］报道，在慢性牙周炎组HBD－1的表达量显著高于牙龈炎组和侵袭性牙周炎组，而侵袭性牙周炎组中HBD－2的表达量最高，与其他两组具有显著性差异。

牙周炎症组织中HBD的表达水平降低以及不同类型牙周炎症组织中HBD表达差异的原因目前尚未完全清楚。可能的机制如下:①牙周炎症时产生不同的致炎因子、抗炎因子、酶类的不同作用影响了HBD的表达，Taggar等［11］研究发现半胱氨酸蛋白水解酶组织蛋白酶B、L、K可下调HBD－2与HBD－3的表达，说明在炎症时升高的组织蛋白酶可能是降低HBD－2、HBD－3表达的原因;②不同牙周微生物对HBD的调控作用可能不同，正常状态下的某些共生菌可诱导机体高表达HBD，使机体处于免疫激活状态。很多研究表明，常见的几种牙周致病菌可通过不同的途径上调或者下调HBD的表达［12－15］。

2.3 几种主要的牙周可疑致病菌对β－防御素的调控作用

实验表明，在体外培养的人牙龈上皮细胞(Human Gingival Epithelial Cells，HGECs)和表皮角蛋白细胞可在炎症因子IL－1、TNF－α、上皮细胞激活剂PMA以及多种细菌的作用下表达HBD－2、HBD－3［16－17］。其中几种主要的牙周可疑致病菌可分别通过不同的方式调控HBD－2及HBD－3的表达。Kazuhisa Ouhara等［12］对体外培养的 HGECs与伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，A.actinomycetemcomitans)接触后表达HBD的研究中发现，A.actinomycetemcomitans的膜外蛋白100(Omp100)是引起牙龈上皮释放HBD－2的成分之一，且与其浓度呈正相关。HBD的释放不仅通过Omp100－纤连蛋白的相互作用而直接释放，也通过炎症引起的细胞因子刺激而二次释放。并且不同的 A.actinomycetemcomitans菌株刺激HGECs所产生的防御素种类和浓度也不同，A.actinomycetemcomitans血清型2339可以促进HBD－2的强烈表达，却不能刺激HBD－3的表达，而A.actinomycetemcomitans血清型99对HBD－3的诱导作用却优于HBD－2。同样可上调HBD－2、HBD－3表达的牙周可疑致病菌还有具核梭杆菌(Fusobacterium.nucleatum，F.nucleatum)，F.nucleatum 可通过细胞壁提取物诱导HBD－2、HBD－3的表达，但对HBD－1的表达则没有诱导作用。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)作为牙周炎的主要致病菌之一，具有高度的蛋白水解性。Chung等［13］研究证明P.gingivalis蛋白水解酶通过蛋白水解酶活化感受器2(PAR－2)和信号通路，调节HGECs对 HBD－2的表达。P.gingivalis对HBD－3的抗菌能力有一定的抵抗性，P.gingivalis的致病菌株 ATCC49417所产生的蛋白水解酶可下调HBD－3的释放且降低其抗菌能力。P.gingivalis上清液对HBD－3的下调作用存在浓度－时间依赖关系。这种下调作用是由于激活的 P.gingivalis蛋白水解酶 RgpB(Arg－gingipain)和 Kgp(lys－gingipain)引起的，而使用对这两种蛋白水解酶的选择性抑制剂预处理P.gingivalis培养上清液可抑制其下调HBD－3的表达，并增加其对 HBD－3 的敏感性［14］，说明P.gingivalis的产物水解蛋白酶可能是使P.gingivalis ATCC49417对HBD－3不敏感的原因之一。

Shin等［15］研究发现，齿垢密螺旋体(Treponema denticola，T.denticola)可抑制人牙龈上皮细胞对HBD的表达，发现有活力的T.denticola可以明显抑制人牙龈上皮细胞对HBD－3的释放，并且同时可以抑制HBD－1，HBD－2的表达。相反，热失活的细菌却可稳定的轻微上调HBD－2和HBD－3的释放。进一步研究发现，T.denticola含有一个Toll样受体2(TLR2)的热依赖抑制剂，T.denticola可通过Pam3CSK途径阻止TLR2被激活，而TLR2轴链正是抑制人牙龈上皮细胞对HBD－3表达的原因。这可为T.denticola引起的牙周炎的研究提供一个新的思路。

另有研究报道，口腔细菌对HBD－2、HBD－3表达的调控，并不是通过核转录因子κB(NF－κB)信号转导途径，而是通过JNK、促细胞分裂原p38所激活的有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)信号通路［17－18］及细胞外钙离子通道［21］。

2.4 β－防御素对口腔菌群的抗菌效果

口腔菌群种类繁多，细菌密度高、数量大，主要成员有需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌。口腔上皮与多种细菌密切接触，其表达的HBD在抗牙周致病菌入侵的天然免疫和获得性免疫中均有重要作用，然而具有广谱抗菌作用的HBD对口腔内不同菌群的抗菌效果也因细菌对HBD的敏感性不同而有明显的差异。体外研究表明，需氧菌，如血链球菌(Streptococcus sanguis)、变异链球菌(Steptococcus mutans)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、衣氏放线菌(Actinomyces israelee)、大肠杆菌(Escherichia coli)较厌氧菌 A.actinomycetemcomitans、P.gingivalis、F.nucleatum、微小消化链球菌(Peptostreptococcus micros)对 HBD－2、HBD－3更为敏感［19］。因此，少量 HBD－2、HBD－3 便可对需氧菌有抑制作用，可助于机体对早期定植菌增殖的控制。对厌氧菌的实验结果则各不相同，F.nucleatum是对HBD最敏感的细菌，P.gingivalis则对HBD有很高的耐受性。与厌氧菌菌种差异性同样明显的还有菌株差异性，例如，F.nucleatum的不同菌株对于HBD的敏感性不同，F.nucleatum血清型21对HBD－3的敏感性非常高，HBD－3浓度为1 mg/L时便可将其完全杀灭，当 HBD－2或HBD－3浓度为共生需氧菌的抑菌浓度250 μg/mL时，对部分菌株无抑制作用，而对部分菌株有效［20］。有学者认为HBD对不同菌种以及菌株的抗药效果的差异，可能与细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的化学成分不同，或者其包膜化学成分不同［19］有关。密螺旋体缺乏传统的 LPS，对HBD有天然的抵抗力，说明同一菌种的不同菌株间LPS及脂低聚糖多样性可能是不同菌株对HBD敏感性不同的原因［22，24］。此外，HBD－3 较家族其他成员的抗菌谱更宽，且对牙周可疑致病菌A.actinomycetemcomitans、P.gingivalis、中间普氏菌(Prevotella intermedia，P.ntermedia)、F.nucleatum 的抗菌活性更强［19］，这可能是由于二者作用靶点不同所致，HBD－2的优先作用靶目标为LPS，而HBD－3可以作用于不同的靶点。

2.5 β－防御素的其他功能

最近一项研究显示，HBD－3除具有多种抗菌活性且外还具有促进成纤维细胞增殖的作用。Wang等［23］在体外对3组牙周炎离体牙组和3组健康对照组分别给予不同的处理，观察牙根表面成纤维细胞的附着和增殖情况。第一组牙周炎离体牙组和健康对照组行龈下刮治及根面平整术(scaling and root planning，SRP)、第二组牙周炎离体牙组和健康对照组行SRP并予100 ng/mL HBD－3涂予牙根表明、第三组牙周炎离体牙组和健康对照组行SRP并予200 ng/mL HBD－3涂于牙根表明。治疗后均接种牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)。实验结果表明，在3组牙周炎患牙组中，200 ng/mL HBD－3组的牙根表面成纤维细胞的附着和增殖水平明显高于另两组，并且后两组的成纤维细胞数要明显的多于仅使用SRP组。在健康对照组中，使用HBD－3的两组，7 d时成纤维细胞生长良好且形成网状结构。说明，HBD－3在抗菌及促进成纤维细胞增长方面均有重要作用，因此可促进牙周组织的再生。同时，HBD－3在感染性疾病中可能具有再生促进作用。

3 展望

防御素在维护口腔健康的过程中起到重要作用，研究表明HBD与多种口腔疾病的发生发展过程关系密切，但目前研究尚处于初级阶段，且多为体外研究，目前仍需进一步研究其在体内的调控途径及与口内细菌的相互作用机制、有无毒性或其他不良反应。HBD拥有广谱高效的抗菌活性，能够快速杀灭广谱抗原微生物，且其作为人体自身活性物质，对其具有抵抗性的细菌较少，细菌不易对其产生耐药性，在口腔局部用药及全身广谱抗菌治疗方面具有广阔的前景，希望能成为牙周疾病以及其他口腔疾病检查、诊断、治疗的有效工具。

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