乳化法制备两歧双歧杆菌微胶囊

陈 合， 王 野， 贾亚丽， 舒国伟

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

双歧杆菌是法国巴斯德研究所的Henry Tissier于1899～1900年从母乳婴儿粪便中分离得到的，是肠内最有益的菌群，双歧杆菌数量的减少乃至消失是“不健康”状态的标志，因此双歧杆菌是人体健康的晴雨表[1-3].双歧杆菌具有调整肠道、防癌、保护肝脏、降低胆固醇、提高免疫功能、抗衰老、抗辐射、预防和治疗乳糖消化不良等多种生理功能[4-6]，人们也已经认识到双歧杆菌是肠道内的生理性益生菌，其在肠道内数量的多少与人的健康息息相关[7].

双歧杆菌是一种专性厌氧菌，对营养条件要求高，对氧极为敏感，对低pH的抵抗力差，活性保持较困难，因而目前市场上销售的双歧杆菌产品液体或粉体制剂活菌数下降很快，产品的贮存稳定性极差，保健功效损失快[8].另外，双歧杆菌要对人体产生有益作用，首先它必须通过胃环境、十二指肠以大量的存活菌到达肠道并定殖于肠黏膜上才能发挥功效[9].但由于双歧杆菌耐酸、耐胆盐能力差，双歧杆菌的活菌数在此过程中也会大幅度下降[10]，因此提高双歧杆菌产品的活菌数显得尤为必要，微胶囊技术是目前提高双歧杆菌活菌数的有效手段之一[11].

本文以两歧双歧杆菌BB01和BB28为试验菌株，活菌数及包埋产率为指标，考察了海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、乳化时间及固定化时间对乳化法制备两歧双歧杆菌微胶囊的影响，为进一步优化两菌株的微胶囊制备条件奠定试验基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及培养基

两歧双歧杆菌BB01和BB28，陕西科技大学生命科学与工程学院实验室保藏.

活化和发酵培养基：均为MRS肉汤(青岛海博生物科技有限公司)，使用时添加0.05%(w/v)半胱氨酸盐酸盐.

计数培养基：MRS琼脂(青岛海博生物科技有限公司).

1.1.2 主要仪器及设备

SW-CJ-1F超净操作台：苏州净化；DH5000AB 电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；手提式蒸汽压力灭菌器：江阴滨江医疗器械厂；78-1磁力加热搅拌器：常州翔天实验仪器厂.

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

MRS肉汤经118 ℃灭菌15 min冷却后，将两歧双歧杆菌BB01和BB03的冻干菌粉分别接种于活化培养基中，37 ℃恒温培养24 h，活化3次后备用.

1.2.2 微胶囊的制备

将已活化的菌种按5%的接种量分别在发酵培养基中，37±1 ℃培养24 h，离心(4 000 r，15 min)收集菌体，用生理盐水将其菌悬液分别调整5.48×109cfu/mL和4.47×109cfu/mL，将菌悬液和海藻酸钠溶液均按1∶10(w/v)的混合，并加入0.4%的吐温80，乳化一段时间后分别用无菌压力喷嘴将乳化液喷入至于磁力搅拌器上的CaCl2溶液中，固化一段时间后，待湿胶囊形成后，用纱布过滤，然后再用生理盐水冲洗3次，初始微胶囊制备条件为海藻酸钠2%，CaCl22%，乳化和固定化时间均为15 min.

1.2.3 活菌计数

将发酵液和微胶囊解囊液分别用无菌生理盐水溶解制成菌悬液，然后将其以10倍梯度稀释，再分别取稀释度为10-7到10-8的菌悬液1 mL接种于高层琼脂培养基计数.37 ℃培养2 d，观察计数取其平均值，并换算为单位体积的活菌数，考察各因素对双歧杆菌微胶囊活菌数存活率的影响.换算活菌数的公式为：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度2个重复平皿菌落平均数×稀释倍数×10，计算出每毫升原菌液活菌总数.

1.2.4 包埋产率计算方法

将制备的双歧杆菌微胶囊用生理盐水洗涤3次后取1 g湿胶囊置于9 mL解囊液中，于37±1 ℃恒温水浴振荡，处理45 min，活菌计数，所得结果乘以湿胶囊的总重量记为N0，微胶囊化前的菌胶混合液中的活菌数记为N

包埋产率=N0/N×100%

2 结果与讨论

2.1 海藻酸钠浓度对制备双歧杆菌BB01和BB28微胶囊的影响

根据初始微胶囊制备条件，将海藻酸钠浓度调整为1.5%、2%、2.5%和3%，按1.2.2制备微胶囊，结果如图1、2所示.

由图1、2可知，随海藻酸钠浓度升高，所制备的双歧杆菌BB01和BB28的微胶囊的活菌数以及包埋产率都是先增加后减少，这可能是海藻酸钠浓度低时，制备的微胶囊强度小，导致菌体泄露，但浓度太大就会使菌胶液的粘度增大不利于乳化，且得到的微胶囊颗粒较大.因此，初步确定双歧杆菌BB01和BB28微胶囊化的海藻酸钠浓度分别为2%和2.5%，其对应的活菌数和包埋产率分别为4.9×109cfu/mL，80%和4.0×109cfu/mL，80%.

图1 海藻酸钠浓度对两歧双歧杆菌BB01 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

图2 海藻酸钠浓度对两歧双歧杆菌BB28 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

2.2 CaCl2浓度对制备双歧杆菌BB01和BB28微胶囊的影响

图3 CaCl2浓度对两歧双歧杆菌BB01 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

根据初始微胶囊制备条件，将固化剂CaCl2的浓度调整为1%、2%、3%和4%，按1.2.2制备微胶囊，结果如图3、4所示.

由图3、4可知，随CaCl2浓度升高，所制备的双歧杆菌BB01和BB28的微胶囊活菌数以及包埋产率都是逐渐减少.CaCl2浓度升高，微胶囊强度应该逐渐增强，但由于盐的浓度升高使微生物活性部分丧失，使湿胶囊的活菌数下降，同时包埋产率也随之降低.观察图3、4可知CaCl2浓度为1%时，双歧杆菌BB01和BB28的包埋效果最好，其活菌数和包埋产率分别为3.06×109cfu/mL，56.7%和4.1×109cfu/mL，92%.

图4 CaCl2浓度对两歧双歧杆菌BB28 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

2.3 乳化时间对制备双歧杆菌BB01和BB28微胶囊的影响

图5 乳化时间对两歧双歧杆菌BB01 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

根据初始微胶囊制备条件，乳化时间分别取5 min、10 min、15 min和20 min，按1.2.2制备微胶囊，结果如图5、6所示.

由图5、6可知，当乳化时间较短时，乳化剂还未来得及均匀的包覆在液滴表面，就进行固化，导致微胶囊颗粒的分散性较差，包埋效果不好，随着乳化时间的继续延长，包埋率急剧下降，这是因为体系破乳的缘故.当乳化时间为10 min时，两歧双歧杆菌BB01的包埋产率最高为40.9%，乳化时间为15 min时活菌数最高为2.47×109cfu/mL，BB28在乳化时间为15 min时，其活菌数和包埋产率分别为1.59×109cfu/mL和87%.

图6 乳化时间对两歧双歧杆菌BB28 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

2.4 固定化时间对制备双歧杆菌BB01和BB28微胶囊的影响

根据初始微胶囊制备条件，将固定化时间分别取5 min、10 min、15 min和20 min，按1.2.2制备微胶囊，结果如图7、8所示.

图7 固定化时间对两歧双歧杆菌BB01 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

由图7、8可知，随着固定化时间变长，所制备的双歧杆菌BB01和BB28微胶囊的活菌数以及包埋产率都是先增加后减少，这可能是由于固定化时间越长，所得固定化凝胶小球的强度越高，菌体不易泄露.但时间太长，由于双歧杆菌对氧气等不利条件极为敏感，所以活菌数和包埋产率下降.因此，初步确定双歧杆菌BB01和BB28微囊化的固定化时间都为15 min，其活菌数和包埋产率分别为4.37×109cfu/mL、54.1%和5.55×109cfu/mL、76.1%.

图8 固定化时间对两歧双歧杆菌BB28 微胶囊活菌数及包埋产率的影响

3 结论

乳化法制备双歧杆菌微胶囊是目前最为常用的方法, 它对活菌损害小，操作方便，便于大规模生产，市场前景广阔.文章通过单因素试验研究了海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、乳化时间和固定化时间对乳化制备双歧杆菌微胶囊的影响，初步确定了两歧双歧杆菌BB01和BB28的微囊化条件分别为：海藻酸钠浓度2%、CaCl2浓度1%、乳化时间10 min、固定化时间15 min和海藻酸钠浓度2.5%、CaCl2浓度1%、乳化时间15 min、固定化时间15 min.

[1] 许时婴，张晓鸣，夏书芹,等.微胶囊技术-原理与应用[M].北京：化学工业出版社，2006:188-189．

[2] 张 帆.肠溶性双歧杆菌微胶囊制备及其相关特性的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2008:1-2．

[3] Shah，N.P..Probiotic bacteria selective enumeration and survival in dairy foods[J].Journal of Dairy Science，2000，83(3):894-907．

[4] 吴克刚，柴向华.食品微胶囊技术[M].北京：中国轻工业出版社，2006:300-303．

[5] 曹永梅，许时婴,等.肠溶性双歧杆菌微胶囊的制备[J]. 食品与发酵工业，1998,25(2)：71-72．

[6] 韩雪等．双歧杆菌的增殖与保藏技术的研究进展[J]．中国乳品工业，2004,32(1)：1-2．

[7] 李武明，张玲华，杨汝德.双歧杆菌的微囊化研究[J].广东药学院学报，1997，13(4):222-225．

[8] 阳 晖，蒋爱民，刘思聪，等．肠溶性益生菌微胶囊的研究[J]．食品研究与开发，2006，27(1):76-78．

[9] Krasaekoopt W, Bhandari B, Deeth H. Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt;a review[J].International Dairy Journal,2003, 13(1):3-13．

[10] Desmond.C.，Ross.R.P.，Callaghan.E.O．Improved survival of lactobacillus paracasei NFBC338 in spray-dried powders containing gum acacia[J].Joumalof Applied Mierobiology，2002，93(6):1 003-1 011．

[11] 唐宝英，朱晓慧，刘 佳．双歧杆菌干燥型微胶囊技术的研究[J]．食品与发酵工业，2003,29(10)：93．