RICTOR对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞活力的影响*

郭 欣， 胡爱玲， 方霖楷， 刘 岩， 潘云峰△

(中山大学附属第三医院1风湿免疫科，2护理部，广东 广州510630)

类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，世界上约0.5%～1%的人群患有RA。滑膜炎症细胞浸润以及衬里层增生是其典型病理表现。衬里层增生的滑膜细胞可分为巨噬样滑膜细胞和成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)。其中 RA-FLS 具有增殖程度增高、侵袭等类肿瘤特性，并发现多个与肿瘤发生密切相关的信号转导系统，如丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路、Wnt/β-catenin通路、核因子 κB(nuclear factorkappa B，NF-κB)通路与磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)通路等，都与 RA的发病、关节破坏和疾病的进程有着密切关系［1-3］。但目前有关其生物学特性及变化机制尚未清楚。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可整合营养、能量及生长因子等多种细胞外信号，参与细胞存活、增殖、分化等。mTOR共有mTORC1和mTORC2两种复合物。mTORC2可磷酸化Akt的Ser473位点，是Akt激活的必要条件，并且与多种肿瘤细胞的幸存、增殖、迁移有关。已有学者发现Akt通路在RA-FLS可被多种细胞因子激活，并参与减弱滑膜细胞对Fas引起的凋亡的敏感性［4］。而作为Akt激活的必要条件，目前尚未见mTORC2与RA的相关报道。RICTOR(rapamycin-insensitive companion of mTOR)为mTORC2特异性的组成蛋白，并是其发挥生物学作用的必不可少的组成部分［5］。本研究通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默RAFLS中RICTOR的表达，观察mTORC2对细胞存活的影响。

材料和方法

1 标本采集

类风湿关节炎患者滑膜组织来自2010年3月至2012年6月中山大学附属第三医院行滑膜清理术或关节置换术，共7例，其中5个取自膝关节、2个取自髋关节。年龄25～62岁，平均40.1岁，其中6名女性。所有RA患者诊断均符合1987年美国风湿病学会(American Rheumatism Association，ARA)类风湿关节炎分类标准。

2 主要试剂

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及高糖DMEM无血清培养基购自Thermo scientific;RNAiso Plus(总RNA提取试剂)、SYBR® Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)及 PrimeScript® RT reagent Kit(Perfect Real Time)均购自TaKaRa宝生物工程(大连)公司;总蛋白提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;靶I抗:兔抗人抗RICTOR多克隆抗体购自Cell Signaling;兔抗人抗磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗体购自Bioworld;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记 II抗购自 Immunology Consultants Laboratory;噻唑蓝(四甲基偶氮唑盐)购自MP Biomedicals;无血清培养基 Opti-MEM I、脂质体 Lipofectamine® RNAiMAX均为 Invitrogen产品。所需siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计并化学合成，RICTOR的siRNA序列:正义链5'-GCGGUUAGCUUUAUUAAAUTT-3'，反义链 5'-AUUUAAUAAAGCUAACCGCTT-3';非特异siRNA(阴性对照)序列:正义链5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反义链5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

3 方法

3.1 细胞培养与鉴定 滑膜组织经无菌条件下处理后，向滑膜组织滴加PBS缓冲液，将其锐性剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm大小，将组织块移至培养瓶中，加入适量10%FBS培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。根据细胞的生长情况及培养液的变化，每2～3 d更换培养液1次。当细胞生长至覆盖底面＞80%时，可进行消化传代培养。经消化传代后获得较纯成纤维样滑膜细胞。鉴定包括光学相差显微镜下观察细胞生长形态和流式细胞术检测CD55阳性细胞率。本实验使用第3～5代滑膜细胞。

3.2 siRNA转染 转染前24 h用不含抗生素的10%FBS培养基消化接种细胞培养板，以每孔2×105个细胞接种于6孔板，以每孔2×104个细胞接种于96孔培养板，使细胞融合度达50% ～80%时开始转染。先用适量无血清培养基Opti-MEM I分别稀释脂质体及siRNA，并轻轻混合，室温孵育10～20 min。将siRNA-脂质体复合物加入细胞培养基中，轻轻前后摇动培养板混合，置于5%CO2、37℃培养箱中孵育5 h，予10%FBS培养基换液，后继续培养箱中孵育 19、43 和 67 h。

3.3 荧光定量PCR法检测RICTOR mRNA的表达转染24 h后6孔板细胞每孔加入RNAiso Plus 1 mL，抽提细胞总RNA并溶于20 μL RNase-free H2O，取2 μL总RNA样品于紫外分光光度计检测A260/A280。按PrimeScript® RT reagent Kit试剂盒说明书进行反转录，反转录反应条件如下:37℃ 15 min，85℃ 5 s。反转录反应产物cDNA依照SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒说明书，行荧光定量 PCR反应。

RICTOR上游引物序列5'-GCTAGGTGCATTGACATACAACA-3'，下 游 引 物 序 列 5'-AGTGCTAGTTCA-CAGATAATGGC-3';GAPDH上游引物序列5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，下 游 引 物 序 列 5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'。反应体系总体积为 20 μL，含 cDNA 模板 1.8 μL，SYBR® Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物、ROX Reference Dye 各0.4 μL，ddH2O 7 μL。使用 ABI PRISM® 7000，设置反应程序:95℃ 30 s后，以95℃ 5 s，60℃ 31 s循环40次，95℃ 5 s，60℃ 31 s;反应结束后分析各样本Ct值，并计算 2－ΔΔCt值。

3.4 Western blotting分析 RICTOR的蛋白表达转染48 h、72 h后收集RA-FLS，用总蛋白提取试剂盒提取胞浆总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，用Western blotting检测其胞浆中RICTOR蛋白表达的变化，即取30 μL总蛋白，经8%SDS-PAGE电泳分离，电转印到PVDF膜，封闭后加入Ⅰ抗(抗RICTOR 1∶500，抗 GAPDH 1∶5 000，取抗体稀释液稀释)，4 ℃摇床孵育过夜，加HRP标记Ⅱ抗(1∶5 000，取抗体稀释液稀释)孵育1 h，最后用增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)化学发光液，于暗室显影后冲洗胶片。用Quantity One软件进行分析，读取吸光度(absorbance，A)及A×mm2值，计算各样本中RICTOR与内参照GAPDH的吸光度值比较，以观察特异性RICTOR siRNA转染组与阴性对照组RICTOR蛋白表达量的变化。

3.5 四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法 实验分4组:①无细胞组:仅加培养液;②空白对照组:加培养液与RA-FLS;③阴性对照组:RA-FLS转染非特异性siRNA;④特异性RICTOR siRNA组:RA-FLS转染特异性RICTOR siRNA。处理24 h、48 h、72 h后向96孔板每孔细胞加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)液振荡使结晶充分溶解。选择490 nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔A值，记录结果，计算各样本与无细胞组A值的差值(ΔA)，比较转染非特异性siRNA与特异性RICTOR siRNA后RA-FLS细胞活力(阴性对照或特异性RICTOR siRNA组ΔA/空白对照组ΔA)。

4 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间差异比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 FLS培养的鉴定

光学显微镜下观察可见细胞呈细长纺锤形，胞核边界清楚，卵圆形，居中，核仁明显，与成纤维细胞形似，鉴定细胞形态与FLS相符，见图1。流式细胞术检测培养的第3代细胞显示CD55表达阳性率达96.8%，见图2，提示所培养的细胞大部分为FLS。

Figure 1.Morphology of RA-FLS observed under optical microscope(×100).Cells were slender and fibroblastlike，while nuclei were clear，ovoid and center.图1 镜下观察第3代RA-FLS形态

Figure 2.CD55 expression of passage 3 RA-FLS detected by flow cytometry.A:blank control;B:CD55 positive.CD55 expression in this case was 96.8%.图2 流式细胞术检测第3代RA-FLS CD55阳性细胞率结果

2 转染siRNAs后对RA-FLS RICTOR mRNA表达的影响

荧光定量PCR技术检测细胞内RICTOR mRNA表达，Ct值经过GAPDH标准化后，特异性RICTOR siRNA转染24 h后，对mRNA干扰效率为(78.36±3.71)%，与阴性对照组比差异有统计学意义(P＜0.01)。

3 转染siRNAs后对RA-FLS RICTOR蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，转染 RICTOR siRNA 48 h、72 h后，RICTOR蛋白表达较阴性对照组明显下降，沉默效率分别为(92.48±6.14)%、(98.57 ±1.40)%(n=7，P ＜0.01)，见图3。

Figure 3.Expression of RICTOR protein in cytoplasm examined by Western blotting after transfection of RICTOR siRNA［RICTOR(－)］for 48 h and 72 h.Compared with control group，the expression of RICTOR was significantly decreased in RICTOR siRNA group.图3 转染siRNA 48 h及72 h后RICTOR的蛋白表达

4 MTT法检测转染siRNA对RA-FLS活力的影响

转染对RA-FLS活力呈时间依赖性，转染24和48 h后，RICTOR siRNA转染组与阴性对照组差异无统计学意义，但转染72 h后，RICTOR siRNA组的细胞活力为(90.14±1.90)%，显著低于阴性对照组(P＜0.01)，见表1。

表1 siRNA转染不同时间后RA-FLS细胞存活力Table 1.The viability of RA-FLS after RICTOR siRNA transfection(%.Mean±SD.n=7)

讨 论

mTOR存在于两种多蛋白复合体—— mTORC1和mTORC2。mTORC1(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1)由mTOR、RAPTOR、mLST8和PRAS40组成，是PI3K/Akt/mTOR通路的重要组成，参与营养平衡、胰岛素作用和细胞生存的调控。而mTORC2，即雷帕霉素不敏感复合体，由 RICTOR、mTOR、mSIN1和mLST8组成。其中，RICTOR是mTORC2的特异性成分，构成mTORC2的支架蛋白。尚有学者发现，用多等位基因打靶敲除的方法降低RICTOR在成纤维细胞中的表达后，可以导致成纤维细胞的增殖率下降，并降低了蛋白激酶Akt的活性和细胞的代谢能力［5］，提示 RICTOR还是 mTORC2发挥生物学作用必不可少的组成部分。目前认为，mTORC2主要作用机制是参与了Akt/PKB第473位丝氨酸磷酸化，而通过降低RICTOR蛋白表达可影响mTORC2功能的发挥和Akt的磷酸化［6］。

Akt又称PKB，即蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化一系列蛋白成分，抑制细胞凋亡，在细胞存活和凋亡中起重要作用。其在人恶性肿瘤中通常高度激活，Akt异常激活意味着肿瘤细胞对凋亡诱导的耐受、细胞增殖生长代谢的异常增加，是目前癌症研究的重要靶标。已有研究发现，磷酸化的Akt及Akt酶活性在RA-FLS中表达升高，并可抑制 TNF-α引起的凋亡反应［7］;且Akt也参与了 TGF-β、fractalkine、lymphotoxin α 等细胞因子对RA-FLS促炎、增殖与抗凋亡的作用［8-10］。此外，Akt还被发现与RA软骨破坏有关［11］，并在巨噬细胞介导的固有免疫中有着关键地位［12］。以上均提示Akt的磷酸化在RA发病机制中起着重要作用，而安全有效的Akt通路抑制剂将可能成为RA治疗研究的新方向。

如今对mTORC2的研究是肿瘤领域的焦点，但其信号通路的功能仍尚待研究。已有学者发现，mTORC2参与了MMP-9活化并可通过PKC途径影响细胞骨架参与神经胶质瘤细胞侵袭，并激活Akt通路促进细胞增殖，抑制凋亡［13］。另外，也有发现阻断mTORC2通路，可促进多发性骨髓瘤、结肠癌肿瘤细胞凋亡、抑制增殖及转移种植［14］;而该通路也被证实参与了乳腺癌细胞骨架变化，影响其趋化和转移能力［15］。RA-FLS是滑膜中特殊的细胞群，RA发病后，其发生了肿瘤样改变，表现为具有逃脱接触抑制的能力，自主增殖程度增高，有侵袭的内在特性。mTORC2是否也参与了RA-FLS的生长异常，目前尚未有相关报道。

本课题利用siRNA介导的RNA干扰技术沉默RA-FLS中mTORC2的特异组成蛋白RICTOR的表达后，可显著降低RA-FLS存活率，推测mTORC2可能参与了 RA-FLS的异常增殖或抗凋亡机制，为mTORC2信号通路在RA-FLS中作用机制的进一步研究提供线索。此外，实验结果显示，转染24 h后，siRNA已开始影响mRNA翻译，并在48 h后明显抑制RICTOR蛋白表达。但RA-FLS细胞存活率在72 h后才出现显著下降，考虑原因是:RICTOR的敲除并非直接抑制RA-FLS生长，它通过减少mTORC2复合物形成，影响下游信号转导通路，从而引起细胞凋亡或增殖减少，这可能与其抑制Akt磷酸化有关，但其下游通路仍有待进一步实验探索及证实。本实验通过沉默mTORC2可抑制RA-FLS生长的发现，为RA发病机制的研究和治疗提供了新思路。

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