线粒体通透性转变在牛磺酸缺乏诱导的细胞凋亡中的作用

■高永超 冯 颖 胡建民

(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161)

牛磺酸是一种β-氨基酸，在兴奋性组织中浓度非常高。尽管牛磺酸在100多年前就被发现，但近些年才探讨其潜在的生理功能，其中包括渗透调节、免疫调节、离子转运调节、能量代谢、胆固醇代谢的调节。

牛磺酸的许多功能是由其结合产物介导的。最近发现的结合产物5-牛黄甲基尿苷-tRNA亮氨酸（UUR）是在UUR的摆动位置形成的，可以稳定tRNA的反密码子环的U-G配对，从而引起UUG的高效解码。因此，牛磺酸缺乏减少了UUG依赖性线粒体编码蛋白合成的速率，从而导致呼吸链受损。这些结果表明，牛磺酸是影响氧化磷酸化和线粒体过氧化物产生率的一个关键因素，后者引起电子从呼吸链转移到受氧体。

已有研究证实，牛磺酸可作为一种细胞保护剂。据Lang等报道，在T淋巴细胞中添加牛磺酸可显著抑制Fas蛋白（脂肪酸合成）诱导的DNA片段破裂和凋亡细胞，因为牛磺酸缺失可导致细胞凋亡过程中的细胞收缩。Lang等研究表明，预防性添加牛磺酸，可防止细胞收缩过程中的细胞凋亡级联，这说明牛磺酸的细胞保护作用与其渗透调节功能有关。然而，牛磺酸也调节钙的移动和过氧化物的产生，这是细胞存活的决定因素。因此，本试验研究在牛磺酸缺乏的心肌细胞中，活性氧自由基和钙转移对细胞凋亡启动的影响。

1 方法

1.1 心肌细胞的制备

乳鼠心肌细胞取自2～3日龄的Wistar大鼠。酶消化后，非心肌细胞先行贴壁。将未贴壁的细胞在培养液中悬浮，并辅以10%胎牛血清和0.1 mM 5-溴-2-脱氧尿苷，培养过夜。次日，换培养液。处理前，新生心肌细胞在37°C培养2 d，然后用含0 mM（空白）、5 mM β-丙氨酸（牛磺酸转运抑制剂）的培养基培养细胞。

1.2 细胞Ca2+含量

空白组和β-丙氨酸处理组的心肌细胞用2 μM的Indo-1（钙离子荧光探针），37℃条件下处理20 min，冲洗后，共聚焦显微镜观测钙的变化。收缩期[Ca2+]i、舒张期[Ca2+]i的峰值和达到90%舒张所需的时间以与对照组的比值表示。数据表示为两种波长的比值（F410/F490），与[Ca2+]i成比例。

1.3 细胞牛磺酸含量，还原/氧化型谷胱甘肽水平分析

根据Schaffer等的报道，离心前，用冰高氯酸（1 M）和2 mM EDTA进行细胞匀浆。上清液用来测细胞内牛磺酸含量。谷胱甘肽检测试剂盒测定氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型谷胱甘肽（GSH）水平（开曼化工，美国）。

1.4 Western blot分析

1.4.1 Western blot分析测定细胞色素C水平

根据Grishko等所描述的方法，细胞在冰的分离缓冲液（pH值7.25，4°C）中裂解和匀浆。先将匀浆800×g离心2次，然后16 000×g离心。上清液部分作为胞质碎片用于确定细胞色素C的含量。以牛血清白蛋白为标准品，双辛丁酸法进行蛋白浓度测定。样品与5×电泳上样缓冲液等体积混合，进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳。转膜，然后加相应的抗体。ECL化学发光反应分析。

1.4.2 钙磷脂结合蛋白V和碘化丙啶检测

根据Ricci等的方法，在添加和不添加200 nM环孢素A（CsA）—线粒体通透性转换孔（MPT）抑制剂的情况下，细胞分别经0 mM（对照组）、5 mM β-丙氨酸处理48 h，使用TACS膜联蛋白V-FITC试剂盒（Trevigen，美国）测定细胞凋亡的数量。Annexin V和碘化丙啶染色，使用奥林巴斯IX70显微镜（奥林巴斯美国公司）倒置显微镜观察荧光。在显微镜下对五个独立的区域进行明亮的绿色（凋亡）和红色（坏死）核检查。

1.5 统计分析

所有结果以平均值±标准差表示。t检验进行比较，ANOVA与Tukey的对比试验相结合处理数据。P＜0.05被认为有统计学显著。

2 结果

在含有牛磺酸转运抑制剂——β-丙氨酸（5 mM）的培养基中培养离体乳鼠心肌细胞48 h后，细胞内牛磺酸水平下降45%。随着细胞内牛磺酸浓度的减小，凋亡细胞呈时间依赖性增加（见图1）。

在乳鼠心肌细胞的培养液中添加牛磺酸转运抑制剂β-丙氨酸（5 mM），每个时间间隔，收集一些细胞检测牛磺酸含量。在其余的细胞中，检测凋亡细胞的数量。细胞在普通培养基中培养48 h作为空白对照（0点）。

图1 细胞牛磺酸含量及凋亡细胞之间的关系

几个通路可以启动凋亡的级联过程，包括受体信号耦合到caspase活化，内质网破坏和两种类型的线粒体通透性转变（均释放凋亡因子，如线粒体中细胞色素C）。因此，为了确定线粒体通透性改变是否参与β-丙氨酸介导的细胞凋亡，检测了线粒体中细胞色素C的释放。如图2所示，牛磺酸缺乏的心肌细胞胞质中细胞色素C的总量是空白对照组的5倍。

图2 牛磺酸缺乏细胞胞浆中细胞色素C水平（细胞色素C）

线粒体通透性转换有两种机制。一种是线粒体通透性转换孔，简称为MPT，是跨越线粒体内外膜的一个通道。另一种机制，通过Bax和Bak蛋白的激活增加线粒体外膜通透性。我们通过应用MPT抑制剂——环孢素A，分析MPT在β-丙氨酸介导的细胞凋亡中的作用。如图3所示，环孢素A完全阻止了β-丙氨酸介导的细胞凋亡，而对空白对照组的细胞凋亡无影响。尽管细胞色素C从线粒体外膜通透性增加的细胞中也释放出来，但Bax蛋白介导的通透性转换没有增加β-丙氨酸介导的细胞凋亡，因为磷酸化的Bad水平增加而Bcl-2/Bax的比值并没有变化。综上所述，这些数据说明β-丙氨酸介导的细胞凋亡中，MPT的激活是一个重要的引发剂。

图3 在β-丙氨酸处理的细胞中，线粒体通透性转变的启动

[Ca2+]i升高和过度的氧化应激导致MPT通道的开放。线粒体基质中的钙离子结合位点是MPT开放的触发器。钙介导的线粒体损伤与线粒体和胞质中的Ca2+大量聚积有关。由于新生儿心肌细胞的线粒体和细胞质中[Ca2+]i的波动大致相同，因此可以通过检测心肌细胞的钙离子浓度的变化来研究牛磺酸缺乏对线粒体游离Ca2+的影响。图4显示了牛磺酸的消耗对Ca2+周期的主要作用是心肌细胞舒张期的延长，90%舒张时间增加至260%。同时，在牛磺酸缺乏的心肌细胞中，舒张期Ca2+含量与对照组相比没有发生变化，而收缩期钙离子浓度与对照组相比下降了14%。

由于心脏舒张和收缩时[Ca2+]i仅有轻微的变化，在牛磺酸缺乏的细胞中，Ca2+超载不可能是MPT开放的重要原因。因此，检测了线粒体氧化应激是否造成线粒体MPT孔的开放。如图5所示，牛磺酸缺乏伴随着GSH/GSSG下降45%。因为在低GSH/GSSG的比值时MPT孔开放，在牛磺酸缺乏的心肌细胞中，氧化应激可是触发细胞凋亡的主要原因。

图4 牛磺酸缺乏对钙变化的影响

图5 牛磺酸缺乏细胞中，还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值减小

3 讨论

猫饮食中缺乏牛磺酸和大鼠缺乏牛磺酸转运体，会导致心肌病的发展，其机制尚不清楚。本研究中的结果表明牛磺酸缺乏时细胞凋亡会导致心肌功能障碍。

细胞凋亡是线粒体疾病的一个共同特征。在大多数MELAS（线粒体脑肌病，乳酸性酸中毒和卒中样发作）的情况下，tRNALeu(UUR)的D-环的一个突变减少了tRNA摆动位置的尿苷翻译后修饰。

由于tRNALeu(UUR)的翻译后修饰使得tRNALeu(UUR)的反密码子环的U-G配对稳定，MELAS与UUG的低效解码、抑制依赖UUG的线粒体编码蛋白的合成和减少呼吸链活性有关。呼吸链复合物活性降低导致ATP产生减少，同时由于电子从电子传递链转移给受体氧形成了超氧阴离子自由基导致氧化应激增加。因此，MELAS和牛磺酸缺乏都与过氧化物产生增多有关。然而，在牛磺酸缺乏的情况下，tRNALeu(UUR)翻译后修饰为5-牛黄甲基尿苷-tRNA亮氨酸（UUR）的底物（牛磺酸）减少；而在MELAS，tRNALeu(UUR)的突变改变了tRNA的结构，导致了摆动位置尿苷翻译后修饰的缺陷。

线粒体对氧化损伤高度敏感。线粒体氧化的靶点是线粒体DNA（mtDNA）。尽管线粒体中存在DNA修复系统可以修复线粒体DNA，但是修复系统能被压制，造成严重的线粒体DNA氧化损伤，引发突变或损害线粒体编码蛋白的转录。因为减少线粒体编码蛋白的表达可以进一步减少电子转运通量，增加氧化应激，线粒体蛋白合成受损的恶性循环。这些导致MPT的开放和细胞凋亡的启动。此外，在发生氧化应激的细胞中，关键蛋白的氧化促进了MPT的开放和细胞凋亡。关键蛋白包括腺嘌呤核苷酸移位酶，它参与调节MPT通道的开放和促进线粒体呼吸链的组成部分过氧化物的产生。

本研究在牛磺酸缺乏的心肌细胞中，以谷胱甘肽氧化还原态作为一个氧化应激指标。然而，最近的研究表明，谷胱甘肽氧化还原比值（GSH/GSSG）不仅仅是一个氧化应激指标，而且还是氧化应激的决定因素。据Aon等研究，GSH/GSSG比值与细胞的膜电位和线粒体NADH/NAD比值相关。在GSH/GSSG的比例非常低时，细胞的膜电位降低，MPT开放。在这方面，线粒体中谷胱甘肽过氧化物1的过度表达对细胞保护起着重要作用，GSH和谷胱甘肽过氧化物酶对细胞保护的一个关键步骤是对有毒的氧化剂的清除。这些数据与目前发现一致，GSH/GSSG比值下降与MPT开放有关，线粒体细胞色素C的释放与细胞凋亡级联启动有关。

文章出处：C J Jong,J Azuma,S W Schaffer.Role of mitochondrial permeability transition in taurine deficiency-induced apoptosis.Exp Clin Cardiol,2011,16(4)：125-128.