荧光分光光度法对黄酒氧自由基吸收能力检测方法的建立

黄 玥，陆文蔚，唐立伟，黄灵洁，白 晨*

(上海商学院旅游与食品学院，上海 200235)

荧光分光光度法对黄酒氧自由基吸收能力检测方法的建立

黄 玥，陆文蔚，唐立伟，黄灵洁，白 晨*

(上海商学院旅游与食品学院，上海 200235)

目的：建立用荧光分光光度计测定黄酒氧自由基吸收能力(ORAC)的改进方法。方法：以市售黄酒为样品，使用荧光分光光度计，以荧光半数衰减时间为观察指标，通过Trolox标准曲线，换算得到黄酒的ORAC值，并测定最低检测限、重复性精密度、平行性精密度、加标回收率等。结果：激发波长为490nm，发射波长为517nm。相对荧光半数衰减时间与Trolox浓度的线性回归方程为Y=7.2357X-0.8189，线性决定系数R2为0.9948，检测范围0.28～8.00μmol/L，方法的重复性精密度为3.02%，平行性精密度为2.69%，加标回收率在93.00%～102.00%之间。检测样品的ORAC值为4.68～5.21μmol/mL。结论：ORAC荧光分光光度法简化了操作步骤，缩短了实验时间，同时保证了良好的准确度、精密度和稳定性，适用于测定不同品牌不同年份黄酒的ORAC。

黄酒；发酵酒；氧自由基吸收能力；荧光素；荧光分光光度法

黄酒是以稻米、黍米等为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒，酒精度(以体积计)为8%～20%，历来以营养丰富、保健养生著称，是行家推崇、民间赞赏的传统保健养生佳品[1]。近年来，已有学者开始对黄酒抗氧化活性进行研究[2-6]，目前抗氧化活性评价方法很多，但尚未建立黄酒抗氧化活性评价的完善体系。

氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)，又译为总抗氧化能力，其检测方法——ORAC法是近年来国际推荐的抗氧化活性分析标准方法之一[7]。该方法使用荧光素(fluorescein，FL)为氧化底物，以2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)作为过氧自由基来源，以抗氧化剂作用下，荧光衰退曲线下面积与荧光自然衰退曲线下面积的差作为衡量抗氧化剂的抗氧化能力指标，结果以抗氧化剂Trolox作为标准进行表达，用来定量表征样品的抗氧化能力[8-9]。与其他抗氧化活性评价方法相比，ORAC法是以清除自由基为基础的测定方法[10]，该法可提供稳定可控的自由基，这些自由基与生命现象中的自由基具有高度的一致性[9]。基于其生物相关性强、方法准确、灵敏度高等优点[11]，该方法广泛应用于检测保健食品、植物抗氧化提取物、生物样品等的总抗氧化能力[12-16]，但目前国内外有关黄酒ORAC检测的研究尚未见报道，由于黄酒为我国独有酒种，因而有必要建立黄酒ORAC检测方法。

ORAC法以往一般使用全自动荧光酶标仪作为测定仪器，由于该机器价格昂贵，限制了ORAC法在我国的普及，与之相比，荧光分光光度计价格低廉、应用广泛[8]；另外，观察指标荧光衰退曲线下面积的检测过程费时费力，相对而言荧光半数衰减时间的测定较为简单。因此本实验使用荧光分光光度计，以荧光半数衰减时间为观察指标，建立黄酒氧自由基吸收能力检测的改进方法，为完善黄酒的体外抗氧化活性评价指标提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

分别选择市售黄酒中销售量较大的两个品牌，品牌Ⅰ(产地上海)、品牌Ⅱ(产地浙江)的3年陈、5年陈、8年陈酒样作为检测样品。

荧光素(fluorescein，FL)、Trolox标准品(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromate-2-carboxylicacid)、2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH) 美国Sigma公司；三水合磷酸氢二钾、二水合磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

970CRT荧光分光光度计 上海现科仪器有限公司；MS105DU电子天平 梅特勒-托利多中国公司。1.3 方法[8-9]

1.3.1 检测波长的选择

取一洁净干燥试管，加入63nmol/L的FL使用液0.3mL、75mmol/L磷酸盐缓冲液3.6mL，充分混合后置于荧光分光光度计中扫描激发和发射光谱图，确定最适宜激发波长和发射波长。

1.3.2 样品检测和标准曲线绘制

黄酒样品用75mmol/L的磷酸缓冲液进行适当稀释(pH7.4)，取0.3mL于样品管中待测。将Trolox储备液(终浓度40μmol/L)加75mmol/L磷酸盐缓冲液依次稀释成浓度为8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25μmol/L六个Trolox标准溶液，取6支洁净干燥试管，对应加入Trolox标准溶液各0.3mL，另取2支洁净试管作为对照管，1支为自由基对照(＋AAPH)管、1支为空白对照(－AAPH)管。样品管和标准溶液管中均加入75mmol/L 磷酸盐缓冲液0.3mL；(＋AAPH)管和(－AAPH)管分别加入75mmol/L 磷酸盐缓冲液0.6mL和3.6mL；然后向各管分别加入终浓度63nmol/L的FL使用液0.3mL，混匀；在检测前除(－AAPH)管外向各管加入终浓度6mmol/L的AAPH 3mL，充分混匀并开始计时，记录荧光半数衰减时间t。

荧光半数衰减时间的记录方法：以(－AAPH)管的荧光值为一个单位，当荧光值降低到0.5个单位时所用的时间即荧光半数衰减时间。

连续测定自由基对照管(＋AAPH)荧光半数衰减时间8次，均数记为t+AAPH。

计算标准溶液和样品的相对荧光半数衰减时间，即：荧光半数衰减时间-t+AAPH，以标准溶液相对荧光半数衰减时间为纵坐标，Trolox 浓度为横坐标绘制标准曲线，以样品的相对荧光半数衰减时间比对标准曲线，得到样品对应Trolox浓度，通过换算得出样品的ORAC值。检测样品的ORAC值以1mL样品等同于Trolox的物质的量表示，单位为μmol/mL。

ORAC值/(μmol/mL)= (tsample-t+AAPH)/(tTroloxt+AAPH)×Trolox浓度/(μmol/L)×10-3×(VTrolox/Vsample)×样品稀释倍数

式中：VTrolox/Vsample为检测体系中使用的Trolox体积和样品体积之比。

1.3.3 最低检测限

连续测定自由基对照管(＋AAPH)荧光半数衰减时间8次，得到标准偏差s，最低检测限=3s/K。式中，K为标准曲线斜率。

1.3.4 重复性精密度

每天取1mL黄酒样品用75mmol/L的磷酸缓冲液稀释至1000mL，准确量取稀释后的样品0.3mL，连续测定5d，分别计算ORAC值及RSD值。

1.3.5 平行性精密度

准确量取经稀释后的黄酒样品0.3mL 5份，分别计算ORAC值及RSD值。

1.3.6 加标回收率

准确量取1mL黄酒样品2份，向其中一份中定量加入0.5mg Trolox(即2μmol Trolox)，用75mmol/L的磷酸缓冲液分别稀释至1000mL，然后取分别取0.3mL经稀释后的样品，按1.3.2节方法平行操作，重复测定荧光半数衰减时间5次，计算加标回收率。

1.4 数据统计

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

首先，设定激发波长为485nm，扫描发射波长，得最大发射光谱峰在517.2nm(图1A)。然后设定发射波长为517nm，扫描激发波长，得最大激发光谱峰在490.4nm(图1B)。因此，确定检测的最佳激发波长为490nm、发射波长为517nm。

图1 FL发射(A)和激发(B)光谱图Fig.1 Excitation spectrum of sodium fluorescein

2.2 Trolox标准曲线

由于本文考虑的是齐次Boltzmann方程，所以先简单回顾下关于齐次Boltzmann方程已经解决的问题.1971年Arkeryd首先利用逼近的方法解决了在硬势、角截断条件下解的存在性[4]，不久他进一步利用L1 空间中的弱紧性及碰撞算子的弱形式证明了在-1≤β<0及非角截断情形弱解的存在性[5].1997年， Goudon推广了这种方法， 在-2≤β<0情形下证明了解的存在性[6].随后Villani深入研究了-4<β> <-2时的情形，并给出了新型的弱解[7]， 由于此类解与熵有关， 将其称为H解.β

实验结果表明，t+AAPH为9.43min，相对荧光半数衰减时间(Y)与Trolox浓度(X)有良好的线性关系，线性回归方程为Y=7.2357X-0.8189，线性决定系数R2为0.9948。

文献[17]采用ORAC酶标仪法，以荧光衰退曲线下保护面积为纵坐标、Trolox浓度(1.00～8.00μmol/L)为横坐标绘制标准曲线，线性决定系数R2≥0.994。本检测方法的线性决定系数与文献基本相近，符合检测要求。

用荧光分光光度计测定荧光衰退曲线下面积费时费力，测定一个样品需要间隔2min测一个数据，连续测定120min[8,18-20]，用荧光半数衰减时间替代荧光衰退曲线下面积，则大大简化了数据检测工作量，时间也相对简短，约为60min，因而以荧光半数衰减时间为观察指标具有相对的优越性。

2.3 最低检测限

表1结果显示，该方法的最低检测限为0.28μmol/L，因此标准曲线工作范围为0.28～8.00μmol/L。通过对黄酒样品进行稀释，检测数值均在标准曲线工作范围之内，此方法可以满足检测需要。

表1 最低检测限测定结果Table1 The minimum detection limit of the established method

该方法采用FL为荧光指示剂，FL荧光非常稳定，但在自由基作用下会被氧化，如AAPH产生的过氧化自由基能够使FL氧化导致荧光衰退，因此，在有自由基存在的状态下，在一定波长下FL的荧光强度逐渐减弱。本实验使用荧光分光光度计并采用荧光定量，灵敏度高。

2.4 重复性实验由表2可知，方法重复性精密度为3.02%，说明方法重复性较好，检测条件较易控制，检测结果较稳定。

表2 重复性实验结果Table2 Results of repeated experiments

2.5 平行性精密度

表3 平行性实验结果Table3 Results of parallel experiments

表3结果显示，方法平行性精密度为2.69%，说明方法平行性检测误差小，检测结果较满意。

2.6 加标回收率

表4结果显示，加标回收率范围在93.00%～102.00%之间，与文献[8,21]报道的加标回收率(90%～104%)相近，说明该方法较为稳定，此次加标回收率结果较好，说明检测方法误差较小，准确度较高，可以满足检测需要。

表4 加标回收率实验结果Table4 Results of recovery experiments with spiked samples

2.7 黄酒样品ORAC值测定结果

为了能在标准曲线工作范围内进行检测，黄酒样品首先用75mmol/L磷酸盐缓冲液进行稀释(1:1000)，两个品牌不同年份黄酒ORAC值如表5所示，其范围为4.68～5.21μmol/mL，本方法适用于不同品牌不同年份黄酒ORAC值的检测。

表5 黄酒氧自由基吸收能力ORAC(x±s，n==33))Table5 ORAC of Chinese rice wine (x ±s，n==33))μmol/mL

3 结 论

ORAC法在我国应用并不普遍，主要原因是受到了仪器设备的限制，本实验用荧光分光光度计替代全自动荧光酶标仪，用荧光半数衰减时间替代荧光衰退曲线下面积，建立了改进的实验方法。实验结果表明，ORAC荧光分光光度法简化了操作步骤，缩短了实验时间，同时保证了良好的准确度、精密度和稳定性，该方法操作简单，不需昂贵设备，适用于测定不同品牌不同年份黄酒的氧自由基吸收能力。

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Determination of Oxygen Radical Absorbance Capacity in Chinese Rice Wine by Fluorescence Spectrophotometry

HUANG Yue，LU Wen-wei，TANG Li-wei，HUANG Ling-jie，BAI Chen*
(Department of Tourism and Food Science, Shanghai Business School, Shanghai 200235, China)

Objective: To establish a modif i ed method for the determination of oxygen radical absorbance capacity (ORAC) in Chinese rice wine by fluorescence spectrophotometry. Methods: Commercial samples of Chinese rice wine were determined by a fl uorescence spectrophotometer for fl uorescence half-decay time. As a result, a Trolox calibration curve was developed and used to calculate ORAC. The analytical method was validated with respect to limit of detection (LOD), precision for repeated and parallel determinations and spiked recovery. Results: The excitation wavelength was 490 nm, and emission wavelength was 517 nm. The regression equation between relative fl uorescence half-decay time and Trolox concentration was Y = 7.2357X － 0.8189 with R2of 0.9948 and detection range of 0.28–8.00 μmol Trolox/L. The precision for 5 repeated and 5 parallel determinations were 3.02% and 2.69%, respectively. The recovery rates of spiked samples were in the range of 93.00%–102.00%. The ORAC value of Chinese rice wine was 4.68–5.21 μmol Trolox/mL. Conclusion: Fluorescence spectrophotometry is a simple, time-saving, accurate, precise and stable method which is useful to determine ORAC in Chinese rice wines of different ages and from different brands

Chinese rice wine；fermented alcoholic beverage；oxygen radical absorbance capacity (ORAC)；f l uorescein (FL)；f l uorescence spectrophotometry

TS207.3；TS261.7

A

1002-6630(2013)18-0189-04

10.7506/spkx1002-6630-201318038

2012-08-23

中央财政支持地方高校发展专项(YC-D-4)；上海商学院教改项目(2012)；2011年度上海市教委重点课程建设项目

黄玥(1981—)，女，讲师，博士研究生，研究方向为营养与食品安全。E-mail：huangysh@126.com

*通信作者：白晨(1969—)，女，教授，博士，研究方向为食品营养。E-mail：baichen@fudan.edu.cn