顶空固相微萃取-气质联用法测定山楂核烟熏液的挥发性风味物质

姜绍通，王 旗，蔡克周，潘丽军

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009)

顶空固相微萃取-气质联用法测定山楂核烟熏液的挥发性风味物质

姜绍通，王 旗，蔡克周，潘丽军

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230009)

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)联合气质联用(GC-MS)测定山楂核烟熏液挥发性风味物质。通过比较不同萃取头、萃取温度以及萃取时间对萃取效果的影响，获得较适的萃取条件为：50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头、萃取温度40℃、萃取时间50min。采用GC-MS对解吸物进行测定的结果表明，其挥发性风味物质的主要成分中酚类

顶空固相微萃取；气质联用；挥发性风味物质；山楂核烟熏液

烟熏食品由于其独特的风味深受人们喜爱[1]。传统方法通过控制燃烧木材产生的烟雾和高温对食品进行熏制，这种方法虽然可以赋予食品良好的色泽和烟熏香味，但是烟雾中大量的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)会给食品带来污染[2]。国外在20世纪80年代尝试以天然植物(如枣核、山楂核等)为原料，经高温干馏、提纯精制得到液体烟熏香味料[3]，经过精制分离的液体烟熏香味料，不仅保留对香味起作用的重要组分，更可以极大地降低有毒化合物的含量[4]，是一种食用安全的食品添加剂。我国科学家在20世纪90年代开始以山楂核为原料，经过控制性发烟燃烧、烟气冷凝、分馏、精制等工艺，制备出山楂核烟熏香味料[5]，并且制定了烟熏香味料行业标准，对主要成分进行规范限定[6]。但是至今混合物主要成分仍然没有见报道，特别是其挥发性香气成分仍然不清楚。

固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)技术是20世纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理与富集技术[7]。顶空固相微萃取(HS-SPME)是将SPME萃取头置于样品顶空中的萃取法[8]，它广泛应用于挥发、半挥发性成分的检测，具有灵敏度高、重复性及线性好、操作简单方便快速等特点，并能较真实的反映样品的风味组成[9]。

本实验对山楂核烟熏香味料的理化性质和挥发性香气成分进行全面的检测分析，为液体烟熏香味料的应用与质量控制提供分析评价实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂核烟熏香味料 济南华鲁食品有限公司。

无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、酚酞、硼酸、氯化钾、溴酚蓝、盐酸羟胺、硝酸、高氯酸、盐酸、铁氰化钾、硼氢化钠、硫脲、硫酸、无水硫酸钠、2,6-二氯醌氯亚胺、愈创木酚(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；苯并芘标准品(分析纯) 百灵威有限公司。

1.2 仪器与设备

QP2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；SPME手动进样手柄及萃取头(100μm PDMS； 65μm PDMS/DVB；75μm CAR/PDMS；50/30μm DVB/CAR/ PDMS) 美国Supelco公司；721型分光光度计 上海光谱仪器有限公司；分析天平 上海海康电子仪器；PH-107袖珍数显笔式酸度计 广州铭睿电子科技有限公司。1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：DB-5ms石英毛细柱(30m×0.25mm，1μm)；升温程序：起始温度40℃，保持2min，然后以8℃/min的升温速率升温到70℃，再以5℃/min的升温速率升温到200℃，最后以15℃/min的升温速率升温到250℃，保持2min；汽化室温度：250℃；载气(He)流速2.0mL/min；分流比：1:1。

1.3.2 质谱条件

电子电离(electron ionization，EI)离子源，电子能量70eV，灯丝发射电流200μA，离子源温度240℃，接口温度250℃，质量扫描范围m/z 35～450。

1.3.3 萃取头的老化处理

萃取头在第1次使用时，需要按照厂家说明在气相色谱进样口于250℃老化2h以上至无杂峰，以后使用前需于250℃处理30min，以确保脱去其可能吸附的挥发性成分[10]。取2mL山楂核烟熏液置于15mL的样品瓶中，将SPME针管插入样品瓶，调整并固定萃取头在样品瓶中的位置，伸出纤维头。待吸附完毕，缩回纤维头，抽出针头，将萃取头插入GC-MS联用仪，于250℃解吸2min，进行GC-MS检测分析。

1.3.4 萃取工艺条件优化实验

固相微萃取过程中影响萃取效果的主要因素包括萃取头的种类、萃取温度及萃取时间[11]。萃取工艺条件优化实验以总峰面积和检出峰的个数为指标[12]，通过单因素试验考察各因素对顶空固相微萃取效果的影响，并确定较优的萃取工艺。对于萃取头的优化，本实验采用的4种萃取头分别为：100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS，在吸附温度40℃，吸附时间40min，解吸时间2min条件下进行萃取实验；对于萃取温度的优化，采用50/30μm DVB/CAR/ PDMS萃取头，在吸附温度分别30、40、50、60℃，吸附时间40min，解吸时间2min条件下进行萃取实验；对于萃取时间的优化，采用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头，吸附温度40℃，吸附时间30、40、50、60min，解吸时间2min条件下进行萃取实验。

1.3.5 基本理化性质的测定

色状的检定方法：将试样置于一洁净白纸上，用目测法进行观察；香气的评定：参考GB/T 14454.2—2008《香料：香气评定法》进行评定；相对密度的测定：参考GB/T 11540—2008《香料：相对密度的测定》进行测定；酸含量的测定：参考GB/T 14457.4—1993《单离及合成香料：酸值或含酸量的测定》进行测定；酚含量的测定：采用修正吉布斯法进行测定；羰基化合物含量的测定：参考GB/T 14454.13—2008《香料：羰值和羰基化合物含量的测定》进行测定；重金属含量的测定：参考GB 5009.12—2010《食品中铅的测定》进行测定；砷含量的测定：参考GB/T 5009.11—2003《食品中总砷及无机砷的测定》进行测定；苯并(a)芘含量的测定：参考GB/T 5009.27—2003《食品中苯并(a)芘的测定》进行测定。

1.4 数据处理

1.4.1 定性分析

通过GC-MS分析软件，化合物经计算机检索与计算机标准谱图库NIST 05及NIST 05S中的数据比较(最大值1000)，相似指数(similarity index，SI)800以上即为确认化合物。

1.4.2 定量分析

按峰面积归一法计算化合物相对含量。

2 结果与分析

2.1 山楂核烟熏香味料的基本理化性质

表1 山楂核烟熏液的基本理化性质Table1 Pphysical and chemical properties of liquid smoke flavoring

由表1可知，山楂核烟熏液是具有浓郁烟熏风味的淡黄色液体，其中酸、酚及羰基化合物的含量较高，分别达到12.414%、5.707mg/mL及3.834g/100mL。同时检测出烟熏液中苯并(a)芘含量为0.7μg/kg，而重金属和砷的含量未检出，完全符合GB 2762—2005《食品中污染物限量》对于食品中苯并芘、重金属及砷的限量指标。

2.2 萃取条件优化

2.2.1 萃取头的选择

图1 不同萃取头的萃取效果Fig.1 Effects of different fibers on extraction efficiency

萃取头是整个固相微萃取装置的核心，萃取头涂层材料不同对物质的萃取吸附能力有影响[13]。一般选择SPME萃取头应根据所分析物的分子质量和极性。

由图1看出，对山楂核烟熏液挥发性成分的总吸附量来说，50/30μm DVB/CAR/PDMS(总峰面积为3.69×107)显示出良好的吸附能力，吸附量最大，其次为65μm PDMS/DVB(总峰面积1.36×107)，75μm CAR/PDMS(总峰面积1.29×107)和100μm PDMS(总峰面积0.93×107)，说明50/30μm DVB/CAR/PDMS的吸附能力比其他的萃取头强。吸附挥发性成分数目最多的是50/30μm DVB/ CAR/PDMS(总峰个数100)，其次为65μm PDMS/DVB(总峰个数75)，100μm PDMS (总峰个数63)和75μm CAR/ PDMS(总峰个数55)。因此，对山楂核烟熏液而言，50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头更为合适，不仅吸附能力强，而且分离解吸出的成分比较多。Howard等[14]认为采用DVB/CAR/PDMS萃取头对于易挥发性组分和极性化合物的分析更为有效，与本实验研究结果一致。因而选择50/30μm DVB/CAR/PDMS作为实验用萃取头。

2.2.2 萃取温度的选择

萃取温度对SPME法吸附样品的影响具有两面性，一方面，温度升高会加快样品分子热运动，导致液体样品蒸汽压的增大，有利于分析物在基质中的扩散，从而缩短平衡时间，尤其对于顶空固相微萃取；另一方面，萃取头涂层的吸附是一个放热过程，过高的温度会使分配系数下降，直接导致吸附量下降和检测灵敏度的降低[15]。

图2 不同萃取温度的萃取效果Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由图2看出，随着萃取温度的升高，总峰面积和总峰个数均在40℃时达到最大值，高于40℃后总峰个数减少，在60℃时总峰面积虽有所增加，但硅氧烷类杂质峰的个数明显增加，这可能是由于温度过高萃取头的吸附速率低于解吸速率。因此，选用40℃作为萃取温度。

2.2.3 萃取时间的选择

萃取时间是指待测物在各相达到或接近平衡的时间，影响萃取时间的因素主要有萃取头涂层的厚度及理化性质、分配系数、样品的扩散系数、顶空体积、萃取温度等[16]。萃取开始时萃取头涂层中物质浓度增加得很快，吸附速度快，接近平衡时速度会减慢，因此萃取过程中不必达到完全平衡，在接近平衡时即可完成萃取过程。

图3 不同萃取时间的萃取效果Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

由图3看出，随着萃取时间的延长，总峰面积呈不断上升的趋势。在30～50min时，随着萃取时间的延长，总峰个数增加，但是由于存在吸附-解吸平衡问题，60min时检出的总峰个数却减少了。因此，综合考虑选择50min为萃取时间，此时检出的化合物种类最多，吸附的样品量也足够用于气质联用分析。

2.2.4 山楂核烟熏液挥发性成分的分析鉴定

山楂核烟熏液样品用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头在40℃条件下萃取50min后用GC-MS检测，通过谱库检索鉴定出79种挥发性风味化合物，其中酚类20种、酮类16种、酯类9种、呋喃类6种、酸类6种、醛类3种、醚类3种，其他为含氮或苯环、杂环化合物，挥发性风味化合物的相对含量见表2。

表2 山楂核烟熏液样品的GC-MS分析结果((n==33))Table2 Volatile compounds identified by GC-MS in liquid smoke flavoring (n==33))

续表2

从表2可以看出，山楂核烟熏液的挥发性成分中有55.526%酚类物质、18.710%酯类物质、16.162%醛类物质、3.252%酮类物质、2.108%呋喃类物质、1.019%酸类物质和其他含氮、苯环或杂环化合物。酚类物质是烟熏香味的主要来源[17]，也是抗氧化的最有效成分[18]，具有一定的防腐除臭作用，可用于食品的抗菌防腐和抗氧化酸败。但单纯的酚的烟熏味较为单调，糠醛、乙酰呋喃等能提供甜香和花香气味，使强烈的酚的烟熏气味变得较为缓和，令人愉快能接受[12]。酚类与醛的氧化聚合反应及同肉蛋白的褐变反应可形成加工肉食中烟熏色泽[19]。由于醛类阈值较低，对山楂核烟熏液的整体香味贡献很大[20]，例如具有苦杏仁气味的糠醛是美拉德反应的特征产物[21]。有机酸具有抗菌、调味等功效，在加工肉食中与羧酸反应促使肉蛋白和脂肪凝结，使肉的表面形成一层薄膜，有助于烟熏色泽的保持[22]。山楂核烟熏液中的各种有机成分相互协同作用，使烟熏液的烟熏香气保持浓郁纯正、引人食欲[23]，在实际应用中发挥出人工合成所无法替代的效果。

3 结 论

3.1 通过国家标准方法检测山楂核烟熏液，其中酸含量为12.414%，酚含量为5.707mg/mL，羰基化合物含量为3.834g/100mL，苯并(a)芘含量为0.7μg/kg，未检出重金属及砷含量。

3.2 对4种不同萃取头的比较结果表明，50/30μm DVB/ CAR/PDMS萃取头对山楂核烟熏液的风味物质有较好地吸附能力；综合考察萃取条件确立的较优组合参数为：50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头、萃取温度40℃、萃取时间50min。

3.3 山楂核烟熏液中挥发性成分主要是酚类化合物占55.526%、酯类化合物占18.710%、醛类化合物占16.162%、酮类化合物占3.252%、呋喃类化合物占2.108%、酸类化合物占1.019%。

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Analysis of Volatile Flavors in Liquid Smoke Flavoring by Head-Space Solid Phase Microextraction and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

JIANG Shao-tong，WANG Qi，CAI Ke-zhou，PAN Li-jun
(Key Laboratory for Agriculture Products Proceeding of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Liquid smoke flavoring, also known as wood vinegar, has been applied to a variety of low temperature meat products. In order to ascertain the flavor characteristics of liquid smoke flavoring, its volatile compounds were evaluated by head-space solid phase micro-extraction (HS-SPME) and capillary gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Extractions conditions such as different SPME fibers, extraction time and extraction temperature were optimized in this study. The optimal extraction conditions were obtained as follows: 50/30 μm DVB/ CAR/PDMS fiber and adsorption for 50 min at 40 ℃. Phenols, esters, aldehydes, ketones, furans and acids were the major flavor compounds of liquid smoke flavoring with relative contents of 55.526%, 18.710%, 16.162%, 3.252%, 2.108% and 1.019%, respectively.

head space solid phase micro-extraction (HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；volatile flavor compound；liquid smoke flavoring

TS207.3

A

1002-6630(2013)18-0206-06

10.7506/spkx1002-6630-201318042

2012-09-02

安徽省战略性新兴产业项目(11010301017)；中央高校基本科研业务费专项(2012HGBZ0184)；淮北市重大科技攻关项目(20120103)；合肥工业大学大学生创新性实验计划项目(2011CXCY379)

姜绍通(1954—)，男，教授，本科，研究方向为农产品生物化工。E-mail：jiangshaotong@yahoo.com.cn

占55.526%、酯类占18.710%、醛类占16.162%、酮类占3.252%、呋喃类占2.108%、酸类占1.019%。