章鱼肠道产蛋白酶菌的筛选、产酶条件及酶学性质

任 佩，金玉兰，朴美子,*

(1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109)

章鱼肠道产蛋白酶菌的筛选、产酶条件及酶学性质

任 佩1，金玉兰2，朴美子1,*

(1.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109；2.青岛农业大学化学与药学院，山东 青岛 266109)

采用检测水解透明圈和测定蛋白酶活力的方法，从章鱼肠道中分离筛选出一株高产蛋白酶的菌株QDV-3，并对其产酶条件及酶学性质进行研究。结果表明：QDV-3菌株在以果糖为碳源，蛋白胨为氮源，培养基初始pH8.0，培养温度30℃的条件下振荡培养3.5d时，所产蛋白酶活力最高，Mn2+和Ba2+对菌株产蛋白酶有促进作用。所产蛋白酶在SDS-PAGE电泳上显示至少有5种蛋白酶，分子质量范围为32.4～124.2kD，蛋白酶的最适作用温度为50～60℃，最适作用pH值为9～11，在50℃条件下保温1h，剩余酶活力为95%，热稳定性较好。

产蛋白酶菌；蛋白酶；酶学性质

蛋白酶主要来源于动物、植物和微生物，微生物产的蛋白酶约占世界范围内蛋白酶总产量的60%[1]，广泛应用于洗涤剂、食品加工、医药、丝绸及废物利用等各个领域[2-3]。产蛋白酶的微生物有很多种，包括细菌、真菌、酵母菌和放线菌等，工业用蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，如Alcalase等。

鱼类肠道中存在大量的细菌等微生物群落，这些共生菌能够分泌各种酶类辅助消化食物，国内外对消化道中产蛋白酶微生物的研究已有报道[4-7]，王福强等[8]从牙鲆肠道内筛选出25株产蛋白酶的菌株，其中4株产酶活力特别强，有望作为益生菌应用于水产养殖。冯新忠[9]从额尔齐斯河野生丁鰄产道中分离出40株蛋白酶产生菌，并对产蛋白酶活性最高的菌株进行了产酶条件的研究，但目前从章鱼肠道菌中获得蛋白酶并对蛋白酶性质进行研究尚未见报道，章鱼(Octopus vulgaris)属软体动物门头足纲动物，学名蛸，俗称八爪鱼、八带鱼[10]，主要以贝类、虾蟹为主食。本实验从章鱼肠道中分离筛选出高产蛋白酶菌株，并对产酶条件和酶学性质进行研究，为该菌株及微生物蛋白酶的工业应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

章鱼购于青岛市城阳区水产品市场，实验前于实验室暂养3d，暂养温度＜10℃，暂养期间不喂食，每天换水2次。

选择培养基：2216E培养基[11]、VNSS培养基[11]；酪蛋白培养基：酪蛋白1%、酵母膏0.1%、琼脂1.5%、pH7.2、海水配制；液体发酵培养基：蛋白胨0.5%、酵母膏0.1%、磷酸高铁0.01%、pH7.6～7.8、海水配制；偶氮酪蛋白(azocasein)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、SDS、过硫酸铵(AP)、TEMED等电泳相关试剂及标准蛋白质样品 美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DU-800型紫外分光光度计 美国贝克曼公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DHP-9032电热恒温培养箱 中国龙口市先科仪器有限公司；IS-RDV3立式恒温振荡器 美国精骐有限公司。

1.3 方法

1.3.1 初筛

将活章鱼解剖，取其肠道，用无菌海水冲洗数次，去掉肠道杂物，将肠道剪碎，加入少量无菌海水研磨，得到菌液原液，将原液稀释成10-1、10-2浓度梯度，分别涂布于2216E培养基和VNSS培养基上，于25℃恒温培养箱中培养。

挑取培养基上的单菌落，稀释划线培养于LB培养基上，25℃培养1d，得到纯的单菌落，将单菌落点种于酪蛋白培养基上，观察各菌株产透明圈情况。

1.3.2 复筛

将产透明圈的菌株接种于液体发酵培养基上，于25℃摇瓶培养3d，4℃、10000r/min离心15min，取上清液，测定上清液的蛋白酶活力，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株，作为出发菌株。

1.3.3 蛋白酶活力测定方法

采用偶氮酪蛋白法[12]，0.1%偶氮酪蛋白溶于0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中作为底物，37℃条件下测定酶活力。

1.3.4 最适发酵条件

1.3.4.1 不同碳源和氮源对菌株产蛋白酶的影响

在液体发酵培养基的基础上分别添加质量浓度为0.5g/100mL的葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉、蔗糖作为碳源，考察不同碳源对产酶的影响。在确定最适碳源后，分别以质量浓度为0.5g/100mL的蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钠、酪蛋白作为氮源，考察不同氮源对产酶的影响，培养条件均为25℃、180r/min摇瓶培养3d，4℃、6000r/min离心15min，除去菌体。

1.3.4.2 培养基起始pH值对菌株产蛋白酶的影响

调节培养基起始pH值分别为5、6、7、8、9、10、11，在25℃、180r/min条件下摇瓶培养3d，在4℃、6000r/min条件下离心15min，除去菌体，测定上清液的蛋白酶活力。

1.3.4.3 培养时间对菌株产蛋白酶活力的影响

将菌株在25℃、180r/min条件下摇瓶培养，每12h取样，4℃、6000r/min离心15min，除去菌体，测定上清液的蛋白酶活力。

1.3.4.4 培养温度对菌株产蛋白酶活力的影响

将菌株分别在20、25、30、35、40、45、50℃的条件下摇瓶培养，在4℃、6000r/min条件下离心15min，除去菌体，测定上清液的蛋白酶活力。

1.3.4.5 金属离子及表面活性剂对菌株产蛋白酶活力的影响

在液体发酵培养基中分别添加Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+及表面活性剂吐温-80和聚乙二醇，考察金属离子和表面活性剂对菌株及蛋白酶活力的影响，发酵结束后在4℃、6000r/min条件下离心15min，除去菌体，测定上清液的蛋白酶活力。

1.3.5 酶学性质

1.3.5.1 粗酶液制备

将QDV-3菌株在1.3.4节得出的最适发酵条件下进行液体发酵，发酵液在4℃、6000r/min条件下离心15min去除菌体得到上清液，记为粗酶液。

1.3.5.2 SDS-PAGE电泳

制备浓缩胶为3.75%，分离胶为12.5%，胶片厚度为1.0mm的胶对粗酶液进行电泳。电泳完成后，将分离胶置于复性缓冲液(2.5% TritonX-100)中在4℃条件下浸泡30min以恢复蛋白酶的活性，再置于3.0g/100mL的酪蛋白中4℃条件下浸泡1h，在反应缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl、pH8.0)中37℃振荡反应3h。然后进行染色和脱色，观察胶片上蛋白酶的显色程度，蛋白酶反应部位有亮白色条带，其余部分为深蓝色。

将蛋白质标准样品在进行完电泳后单独切下进行常规的染色和脱色，粗酶液则进行上述活性处理，根据相对迁移率和分子质量的对数关系，做出蛋白质标准样品的线性方程，计算出蛋白酶条带的分子质量。

1.3.5.3 温度和pH值对蛋白酶活力的影响

将粗酶液分别在10～80℃的条件下进行酶活力的测定。确定最适温度后，在37℃、pH7～13的条件下分别测定酶活力，其中pH7～9缓冲液采用0.1mol/L Tris-HCl缓冲体系，pH10～13缓冲液采用0.1mol/L Gly-NaOH缓冲体系。

1.3.5.4 蛋白酶的热稳定性测定

将粗酶液分别在10～80℃条件下保温60min，在37℃、pH8.0的条件下测定其剩余酶活力，以未处理的蛋白酶为对照，记为100%。

2 结果与分析

2.1 产蛋白酶菌株的筛选

酪蛋白培养基上水解透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d比值)越大说明产酶能力越强。菌株的初筛结果如表1所示，共得到6株在酪蛋白培养基上产透明圈的菌株，其中VNSS培养基筛选出来2株，分别为命名QDV-1和QDV-3。2216E培养基筛选出来的菌株为4株，分别为QDE-1、QDE-2、QDE-5、QDE-7。其中QDV-3和QDE-5菌株所产透明圈直径和菌落直径比值较大。

表 1 章鱼肠道产蛋白酶菌株初筛结果(±s,n＝3)Table 1 Results of primary screening of 6 protease-producing bacterial strains from Octopus vulgaris intestine(±s,n＝3)

表 1 章鱼肠道产蛋白酶菌株初筛结果(±s,n＝3)Table 1 Results of primary screening of 6 protease-producing bacterial strains from Octopus vulgaris intestine(±s,n＝3)

菌落编号透明圈直径D/mm菌落直径d/mmD/d值QDV-115.9f0.46.7f0.42.2f0.2 QDV-322.8f0.65.4f0.44.2f0.2 QDE-18.2f0.24.6f0.41.5f0.3 QDE-210.0f0.35.2f0.41.9f0.0 QDE-528.8f0.66.3f0.44.4f0.0 QDE-719.5f1.05.9f0.43.3f0.0

图 1 菌株产蛋白酶能力的比较Fig.1 Comparison of protease production by 6 bacterial strains

将初筛得到的6株菌株分别接种到液体发酵培养基上，进行摇瓶培养，测定各发酵液的蛋白酶活力，结果如图1所示，其中QDV-3菌株产的蛋白酶活力最高，其次为QDE-5和QDE-7菌株，蛋白酶活力分别为85.7、71.5、69.0U/mL，综合水解透明圈和酶活力2个因素，选择QDV-3菌株为出发菌株，进行后续实验。

2.2 产蛋白酶发酵条件的优化

2.2.1 不同碳源和氮源对菌株产蛋白酶的影响

不同碳源对QDV-3菌株产蛋白酶的影响，结果如图2所示，以果糖为碳源时酶活力最高，其次是淀粉，说明该菌株能有效利用果糖，且能够既产蛋白酶又产淀粉酶。消化道中的菌落常常会产多种酶帮助消化食物，王瑞旋等[13]从军曹鱼肠道中分离出8株既产蛋白酶又产淀粉酶的菌株。

图 2 不同碳源对产蛋白酶的影响Fig.2 Effect of carbon source on protease production

图 3 不同氮源对产蛋白酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on protease production

如图3所示，蛋白胨作为氮源时菌株所产蛋白酶活力最高，该结果与其他研究者[14]结果相同，其次是牛肉膏。硫酸铵等无机氮源作为氮源时，蛋白酶的合成量很低，说明菌株能较好地利用营养物质丰富的有机氮源而对无机氮源利用率不高，因为无机氮源被快速代谢利用，抑制蛋白酶的合成。

2.2.2 初始pH值对菌株产蛋白酶的影响

图 4 培养基起始pH值对产蛋白酶的影响Fig.4 Effect of initial medium pH on protease production

如图4所示，培养基的初始pH值为8时，粗酶液中蛋白酶活力最高，QDV-3菌株可以在较广的pH值范围内产蛋白酶，pH值在中性和偏碱性的条件下菌株所产蛋白酶活力均很高。

2.2.3 培养温度对菌株产蛋白酶的影响

如图5所示，QDV-3菌株可在25～40℃范围内生长，最适培养温度为30℃，属于中温菌，菌株的最适温度与章鱼生长的水温及饮食均有关系。

图 5 培养温度对产蛋白酶的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on protease production

2.2.4 培养时间对菌株产蛋白酶的影响

图 6 发酵时间对产蛋白酶的影响Fig.6 Effect of fermentation time on protease production

如图6所示，发酵第0～2天为QDV-3菌株生长期，不合成蛋白酶，发酵第2.5天时菌株开始产蛋白酶，第3.5天时合成的蛋白酶量最大，酶活力最高且之后趋于稳定，因此QDV-3菌株的最适发酵时间为3.5d。

2.2.5 金属离子及表面活性剂对菌株产蛋白酶的影响

如表2所示，Mn2+与Ba2+对QDV-3菌株产蛋白酶有促进作用，适量的Mn2+可促进菌体的生长和酶的生成，表面活性剂对QDV-3菌株产蛋白酶无明显影响，Zn2+和Cu2+对QDV-3菌株产蛋白酶有显著抑制作用。这与冯新忠[9]从额尔齐斯河野生丁鰄肠道中分离筛选的产蛋白酶菌株性质相似。

2.3 酶学性质

2.3.1 分子质量的测定

如图7所示，QDV-3菌株产的蛋白酶在SDS-PAGE电泳上显示有5条亮带，条带较宽，说明至少有5种蛋白酶，分子质量范围32.4～124.2kD。河流弧菌TKU005产的2种蛋白酶分子质量分别为41kD和39kD[15]，Rahman等[16]从铜绿假单胞菌K产的蛋白酶中分离纯化出一种碱性蛋白酶，分子质量为51kD。

2.3.2 最适温度和pH值的测定

图 8 温度对蛋白酶活性的影响Fig.8 Effect of temperature on protease activity

如图8所示，粗酶液中蛋白酶的最适温度为50～60℃，这是多种蛋白酶综合作用的结果，属于中温蛋白酶，微生物产蛋白酶的最适作用温度一般为30～75℃，不同属的细菌所产的蛋白酶最适温度不同，芽孢杆菌属所产的蛋白酶相对耐热，如短芽孢杆菌产的蛋白酶的最适温度为55℃[17]。

图 9 pH值对蛋白酶活性的影响Fig.9 Effect of pH on protease activity

如图9所示，粗酶液中蛋白酶的作用pH值范围较宽，最适作用pH值为9～11。在pH值范围为7～13时，剩余酶活力比较高，且在pH13的强碱溶液中仍能保持80%的活性，表明QDV-3菌株所产蛋白酶为碱性蛋白酶[14]。

表 2 金属离子及表面活性剂对菌株产蛋白酶的影响Table 2 Effects of metal ions and surfactants on protease production

2.3.3 热稳定性的测定

图 10 蛋白酶的热稳定性Fig.10 Thermal stability of proteases

如图10所示，QDV-3菌株所产蛋白酶热稳定性较好，低于50℃时能酶活力保持在95%以上，60℃时能保持70%的酶活力，比摩加夫芽孢杆菌A21产的碱性蛋白酶热稳定性好[18]。细菌和真菌所产蛋白酶的热稳定不同，真菌产的蛋白酶热稳定性较低，而细菌产的蛋白酶较耐热[19]。

3 结 论

从章鱼肠道中分离筛选出了一株高产蛋白酶的菌株QDV-3，对该菌株的产酶条件以及所产蛋白酶酶学性质进行了研究，结果显示，QDV-3菌株在以果糖为碳源、蛋白胨为氮源、培养基初始pH8.0、培养温度30℃的条件下振荡培养3.5d时，所产蛋白酶活力最高，Mn2+和Ba2+对菌株产蛋白酶有促进作用，所产蛋白酶在SDSPAGE电泳上显示至少有5种蛋白酶，分子质量范围为32.4～124.2kD，蛋白酶的最适作用温度为50～60℃，最适作用pH值为9～11，热稳定性较好。本研究旨在筛选出高产蛋白酶的菌株，所产的蛋白酶可大量获得，经研究为碱性蛋白酶，具有活性高、耐热、耐碱、稳定性好等特点，具有很大的工业应用价值，可作为复合酶系用于蛋白质水解获得活性多肽或添加到饲料中用于水产养殖，也可应用于洗涤行业中。

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Screening of Protease-Producing Bacterium from Octopus vulgaris Intestine, Fermentation Conditions and Enzymatic Properties

REN Pei1，JIN Yu-lan2，PIAO Mei-zi1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. College of Chemistry and Pharmacy, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

A protease-producing bacterial strain was isolated and screened from the intestine of Octopus vulgaris by detecting hydrolysis circle of protease and its activity and identif i ed as QDV-3. The optimal fermentation conditions for protease production and its enzymatic properties were also investigated. The highest protease production was achieved when strain QDV-3 was cultured at 30 ℃ for 3.5 d under shaking conditions in a medium at pH 8.0 with fructose as the carbon source and peptone as the nitrogen source. Meanwhile, protease production was improved in the presence of Mn2+and Ba2+. At least fi ve proteases were identif i ed by SDS-PAGE, with molecular weights between 32.4 kD and 124.2 kD. The optimal reaction temperature and pH for the fermentation supernatant were 50ü60 ℃ and 9ü11, respectively. The fermentation supernatant exhibited high thermal stability, and 95% of its initial activity was retained after 1 h incubation at 50 ℃.

protease-producing bacterial strain；protease；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0189-05

2011-11-16

山东省自然科学基金项目(ZR2011CM023)

任佩(1985ü)，女，硕士，研究方向为功能性食品。E-mail：renpei1011@163.com

*通信作者：朴美子(1966ü)，女，副教授，博士，研究方向为功能性食品。E-mail：piaomeizi2009@126.com