臭氧和负离子对镰刀菌M4抑制作用及其机理的初步研究

臭氧和负离子对镰刀菌M4抑制作用及其机理的初步研究

李慧1，黄思1，RASULOV FARRUHBEK2，齐小保1，严守雷1，王清章1，李洁1
（1.华中农业大学食品科学技术学院，武汉，430070；2.Tashkent Chemical Technological Institute）

为了探究臭氧和负离子对莲藕采后主要腐败菌-镰刀菌M4的生长及细胞壁、细胞膜的影响，本试验对处于稳定期的镰刀菌M4分别进行不同条件的臭氧和负离子处理，通过测定抑菌率、细胞壁和细胞膜通透性初步研究臭氧和负离子对镰刀菌M4的抑制作用及其机理。结果显示，臭氧、负离子对镰刀菌M4均有较强的抑制作用,抑菌率与处理时间成正相关；臭氧和负离子之间具有协同作用；臭氧+负离子处理对镰刀菌M4的细胞壁和细胞膜均有显著的破坏作用，破坏程度随处理时间的延长而增加；处理前期主要是电解质的渗出，处理2 h及以上时核酸和蛋白质等大分子物质开始渗出。

镰刀菌M4；臭氧；负离子；抑菌率；细胞壁；细胞膜；通透性

臭氧在常温下是一种不稳定的淡蓝色气体，有特殊的刺激味。由于臭氧的强氧化性和广谱性，因而具有消毒、杀菌、除臭、防霉、保鲜等功能[4]，其杀菌能力仅次于氟，是氯的3倍，杀菌速度极快，是氯的500～3 000倍[5]。一般认为，臭氧杀灭细菌、霉菌类微生物是通过作用于细胞膜，使细胞膜构成受到损害，导致新陈代谢障碍并抑制其生长，进而继续渗透破坏膜内组织，直至细胞死亡[6]。又由于臭氧使用方便、刺激性小、作用快速、无残留污染等优点，被广泛应用于食品保鲜与加工等领域[7]。

负离子是带负电的原子或基团[6]。气体放电过程中产生的负离子具有较高的活性，且有很强的氧化还原作用，能破坏细菌的细胞膜或细胞原生质活性酶的活性，在果蔬保鲜中可以起到抗菌杀菌的目的[8]。同时，负离子还可以分解内源乙烯，钝化酶活性，降低呼吸强度，从而减缓营养物质在贮藏期间的转化。

目前国内对臭氧和负离子的研究多集中于应用保鲜方面，对其抑菌机理报道较少。本试验通过测定抑菌率、细胞壁和细胞膜通透性变化，对臭氧、负离子抑制镰刀菌M4的作用及其机理做了初步探究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

②试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （PDA）由国药集团化学试剂有限公司生产。

③仪器设备 MIC-03臭氧变送器由深圳市蓝月测控技术有限公司生产；XA-1负离子发生器、DDS-11A电导率仪由上海雷磁仪器厂生产；722N分光光度计由上海精密科学仪器有限公司生产；J-E超速冷冻离心机由美国Beckman Coulter Inc生产。

1.2 试验方法

①抑菌率的测定 将镰刀菌在PDA培养基上培养6 d后，在菌落边缘打出直径6 mm的菌饼，移至PDA平板中央，然后将打开盖子的平板立即放入密闭有机玻璃箱中进行以下处理 （温度25℃，湿度50%）：A.臭氧（3 500 mg/m3）、B.负离子（106ions/cm3）、C.臭氧+负离子（臭氧3 500 mg/m3+106ions/cm3），分别处理1，2，3，4 h。每个处理重复3皿，置于25℃下培养3 d，用十字交叉法测定其菌落扩展直径，并计算抑菌率。以不做任何处理的培养基为对照。用抑菌率表示其对镰刀菌M4的抑制效果。

抑菌率（%）=[（对照菌落的平均直径-处理菌落的平均直径）/对照菌落的平均直径]×100%

②对菌体细胞壁的影响 选取C处理的菌饼于PDB培养基中培养，取培养3 d后的菌液，同时不做处理的作为对照组，4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液用分光光度计于510 nm处测定吸光值[9]。

③对菌体细胞膜通透性的影响a.对电导率的影响。选取C处理的菌饼于PDB培养基中培养，取培养3 d后的菌液，同时以不做处理组作为对照，4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液用电导率仪测定电导率，确定金属离子的渗出变化趋势[10]。

b.对大分子内含物渗出的影响。选取C处理的菌饼于PDB培养基中培养，取培养3 d后的菌液，同时以不做处理组作为对照，置于超速冷冻离心机中4℃、10 000 r/min离心20 min，取上清液分别于260 nm和280 nm处测定吸光值[11]。

2 结果与分析

2.1 不同处理条件对镰刀菌的抑制作用

从图1可知，在臭氧 （3 500 mg/m3）、负离子（106ions/cm3）、臭氧+负离子（臭氧3 500 mg/m3+ 106ions/cm3）3种不同处理条件下，抑菌率与处理时间均呈正相关，处理时间越长，抑菌效果越好；且臭氧+负离子处理的抑菌效果均优于臭氧、负离子单独处理，说明臭氧和负离子处理之间具有协同作用，这对于提高镰刀菌生长抑制率具有重要意义。方差分析显示，同一处理时间，3种处理间差异极显著（＜0.01），每种处理中不同处理时间差异极显著（＜0.01）。

2.2 臭氧+负离子对菌体细胞壁通透性的影响

碱性磷酸酶位于细胞的细胞壁和细胞膜的间隙之中，在正常情况下不向外分泌，只有当细胞壁的通透性增大后，碱性磷酸酶才会释放到细胞体外[10]。由图2结合显著性分析可知，处理组与对照组相比，碱性磷酸酶的溶出量显著增加（＜0.05），且随着处理时间的延长，两两之间均有显著差异（＜0.05）。由此说明，臭氧+负离子处理对细胞壁的破坏作用显著，导致其通透性显著变化，且处理的时间越长，对细胞壁的破坏效果越显著。

2.3 臭氧+负离子处理对细胞膜通透性的影响

①臭氧+负离子处理对电导率的影响 由图3可知，处理组镰刀菌M4培养液的电导率显著高于对照组（＜0.05），且随着处理时间的延长，电导率增大，两两之间具有显著差异（＜0.05），说明臭氧+负离子处理的菌体细胞随着作用时间的延长，电解质的渗出量不断增大，细胞膜被破坏。

图1 不同处理条件下的抑菌率

图2 臭氧+负离子处理对菌体细胞壁通透性的影响

图3 臭氧+负离子处理对电导率的影响

②臭氧+负离子处理对大分子内含物渗出的影响 细胞膜的通透性是反映细胞膜完整性的一部分，当真菌细胞膜被破坏后，细胞内的小分子物质首先外泄出来，接着是大分子物质如核酸和蛋白质[2]。为进一步反映臭氧+负离子处理对细胞膜完整性的影响，可以测定渗透到细胞外的核酸和蛋白质的含量。核酸、蛋白质分别在260 nm、280 nm处有最大吸收峰，对260 nm和280 nm吸收物质的检测被广泛应用于测定细胞膜的完整性[12]。

由图4结合显著性分析可知，与对照组相比，臭氧+负离子处理1 h，细胞外液核酸和蛋白质的含量没有显著变化（＞0.05）；臭氧+负离子处理2 h及以上组细胞外液核酸和蛋白质的含量显著增加（＜0.05），且随着时间的延长，吸光值数值增大，处理2 h及以上组细胞外液核酸和蛋白质的含量随时间延长均有显著差异（＜0.05），尤其在处理3 h后差异显著增大。由此说明，臭氧+负离子处理逐步导致镰刀菌M4大分子内含物渗出，且随处理时间延长，这种效应逐渐增大。

综合图3和4分析可知，臭氧+负离子处理对镰刀菌M4的细胞膜有显著的破坏作用，破坏程度随处理时间的延长而增加，处理前1 h主要导致小分子电解质渗出，致使细胞外液电导率显著增加，当处理时间延长至2 h及以上时，核酸和蛋白质等大分子物质才透过细胞膜，渗透到菌体外，处理3 h后核酸和蛋白质等大分子物质开始快速渗出。

3 结论与讨论

本试验初步研究了臭氧、负离子对镰刀菌M4的抑菌作用及其机理，结果表明臭氧、负离子对莲藕采后病原菌镰刀菌M4均有较强的抑制作用，抑菌率与处理时间呈正相关；臭氧和负离子之间具有协同作用；臭氧+负离子处理对镰刀菌M4的细胞壁和细胞膜均有显著的破坏作用，破坏程度随处理时间的延长而增加；处理前期主要是电解质的渗出，处理2 h及以上时核酸和蛋白质等大分子物质开始渗出。可能正是臭氧+负离子处理对细胞壁和细胞膜的这种逐步破坏，导致其通透性增加，细胞内物质外流，影响菌体新陈代谢和生命活动，从而达到对镰刀菌M4的抑制效果。

图4 臭氧+负离子处理对核酸（A）和蛋白质（B）渗出的影响

[1]Busarakom M,Patchimapom U,Marcus N,et al.Effects of pretreatments on coloralterations of litchi during drying and storage[J].European Food Research and Technology,2009, 229(2):329-337.

[2]Jiang T J,Luo S S,Chen Q P,et al.Effect of integrated application of gamma irradiation and modified atmosphere packaging on physicochemical and microbiological properties of shiitake mushroom()[J].Food Chemistry,2010,122(3):761-767.

[3]罗海莉，王清章.莲藕贮藏期病害微生物研究及涂膜保鲜[D].武汉：华中农业大学，2011.

[4]白亚乡，胡玉才，徐建萍.物理技术在食品贮藏与果蔬保鲜中的应用[J].物理，2003（3）：171-175.

[5]梁运章.静电生物效应及其应用[J].物理，1995，24（1）：39-42.

[6]瞿晶晶，何正浩.空气放电葡萄保鲜技术初步研究[D].武汉：华中科技大学，2005.

[7]王文生，石志平，洪霞.空气放电在果品贮藏保鲜中的应用[J].中国果树，2002，13（2）：23-26.

[8]金明，宋冠群，赵丽霞.环境、健康与负氧离子[M].北京：化学工业出版社，2006：50-56.

[9]周先汉，张秀喜，等.蜂胶提取物抑菌活性及其抑菌机理的研究[J].食品科技，2009，34（5）:233-236.

[10]宋磊.BIT对灰霉菌的抑制作用及机理[D].西安：西北大学，2010.

[11]Baez-Sanudo M,Siller J.Extending the shelf-life of bananas with1-methylcyclopropeneand a chitosan-based edible coating[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2009,89(14):2 343-2 349.

[12]高伟，田黎，周俊英，等.海洋芽孢杆菌（） B29987菌株抑制病原真菌机理[J].微生物学报，2009（11）：1 494-1 501.

Inhibition Effects and Mechanism of Ozone and Anion on Fusarium M4

LI Hui1,HUANG Si1,RASULOV FARRUHBEK2,QI Xiaobao1, YAN Shoulei1,WANG Qingzhang1,LI Jie1

We determined the inhibition rate and permeability of cytoderm and cytomembrane of Fusarium M4 with different densities of ozone and gas-phase anion,to study the inhibition effects and mechanism of ozone and anion on Fusarium M4 which caused rhizome rot of lotus root.The results showed that,both the ozone treatment and the gas-phase anion treatment had stronger inhibitory effects on Fusarium M4,and the inhibition rates were positively correlated with processing time. Ozone and gas-phase anion had a synergistic effect on inhibiting Fusarium M4,and the treatment ozone+gas-phase anion damaged the cytoderm and cytomembrane of Fusarium M4 dramatically,moreover the damage aggravated as the processing time prolonged.The electrolyte mainly leaked at earlier stage,and macromolecules such as nucleic acids and proteins began to leak after being treated by two hours.

Fusarium M4;Ozone;Anion;Inhibition rate;Cytoderm;Cytomembrane;Permeability

S182

：A

：1001-3547（2013）18-0098-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.18.031

中央高校基本科研业务费专项资金资助（项目批准号2011JC024）

李慧（1989-），女，硕士，研究方向为农产品贮藏加工质量与安全

李洁（1976-），女，通信作者，副教授，硕士研究生导师，研究方向农产品贮藏加工质量与安全，电话:18071090408，E-mail:lijie1976@mail.hzau.edu.cn

2013-07-30