南瓜中甘油糖脂分离制备及体外抗肿瘤活性研究

蒋志国 王燕华 钟秋平 张海德

（海南大学食品学院1，海口 570228）

（海南大学信息学院2，海口 570228）

南瓜属作物（Cucurbita）为葫芦科南瓜属的世界性蔬菜，在中国栽培十分普遍。随着人民饮食结构的改善和对南瓜营养成分保健价值深入的研究，南瓜越来越受到重视，其栽培面积、单产及总产量迅速增长。近几年南瓜产业在海南发展迅速，2008年种植面积为12万亩，2009年为15万亩，2010年达20万亩，位居海南省蔬菜栽培面积的第4位，已成为海南冬季北运瓜菜的主要种类之一［1］。充分利用海南省丰富的南瓜资源，提高农产品附加值，不断挖掘其新的利用价值和应用领域，具有重要的现实意义。

南瓜的诸多营养保健功能早已为人们所熟知，如降血糖血压、调血脂，防治动脉硬化等［2－3］。迄今为止，有关南瓜中活性成分的分离提取，研究者主要关注的是南瓜中的多糖，但对其中小分子甘油糖脂的分离提取、结构鉴定以及活性研究还未见报道。作为细胞膜的重要组成部分，甘油糖脂具有抗氧化［4－5］、抗病毒［6］、抗炎［7－9］、抗肿瘤［10－13］等多种生物活性。甘油糖脂有效成分的制备分离是进一步研究分子结构、生物活性及构效关系的基础，尽管目前己有多种有效成分的提取分离方法，如高效薄层层析法、柱层析法等，但都不同程度地存在着提取时间长、提取过程繁琐、分离纯化困难等不足［14］。

本研究拟采用高速逆流色谱分离技术与制备型高效液相相结合的方法，以南瓜（Cucurbita moschata）为原料，探索出一套完整的天然产物中有效成分甘油糖脂的提取、分离、纯化的工艺。进而研究其抗肿瘤活性，阐明其构效关系，以期为进一步开发利用南瓜资源提供试验依据，提高农产品附加值。

1 材料与方法

1.1 材料

南瓜（Cucurbita moschata）：海南儋州。小鼠黑色素瘤B16－F10细胞和人结肠癌COLO205细胞：中科院上海细胞库。

DMEM培养基和胰蛋白酶（trypsin）：Gibco公司；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑蓝（3－［4，5－Dimethylthiazol－2－yl］－2，5－diphenylte trazolium bromide，MTT）：美国 Sigma公司；D4020型大孔吸附树脂：天津南开大学化工厂；乙腈（色谱纯）：德国Merk公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

HSCCC－D1200高速逆流色谱仪：浙江工商大学食品与生物工程研究所；K－1800恒流泵：德国Knauer公司；BSZ－100自动部分收集器：上海沪西分析仪器厂；Model 8823A－UV紫外检测器：北京新技术应用研究所。聚四氟乙烯螺旋管缠绕在5个水平轴上形成螺旋管（5 mm I.D.柱容积1 200 mL），转速0～1 000 r／min；ZQ2000质谱检测器：美国 Waters公司；Unity INOVA300，500高分辨核磁共振波谱仪：美国Varian公司；LC－20A分析型HPLC：日本Shimadzu公司；LC－29103制备型 HPLC：日本 JAI公司；ROTARY VACUUM EVAPORATOR N－1000旋转蒸发仪：上海爱朗仪器有限公司；GF254铝膜 TLC板：德国Merck公司。Shellab Model 2300型CO2培养箱：Sheldon Manufacturing公司；DG3022A型酶联免疫检测仪：华东电子管厂。

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理

将冷冻干燥南瓜果肉粉15 kg用95%甲醇常温浸提3次，每次甲醇用量50 L，并不断搅拌。合并浸提液，减压浓缩至无醇味后，将浸膏物分散于5 L蒸馏水中，依次用等体积氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，萃取液减压浓缩后分别得到氯仿浸提物350 g、乙酸乙酯浸提物80 g和正丁醇浸提物100 g。

1.3.2 大孔吸附树脂柱色谱分离

南瓜氯仿浸提物350 g上样后，依次用蒸馏水、30%甲醇、60%甲醇、和90%甲醇洗脱，每次3个柱体积，洗脱液旋转蒸发、冷冻干燥后得60%甲醇洗脱部分（Fr60）6.4 g，待用。

1.3.3 HSCCC溶剂系统的选择

将样品溶解于不同溶剂系统中，剧烈振荡后静置分层，测定其分层时间。用毛细管取近似等量的上下两相溶液于TLC板上。通过观察斑点色度，比较分配系数的差异，选择合适的溶剂系统。展开剂为氯仿－甲醇 －水（65∶35∶10，体积比，下层），显色剂为10%硫酸甲醇溶液。

1.3.4 溶剂系统的准备

本试验所用溶剂系统为氯仿－石油醚－甲醇－水（5∶2∶6∶4，体积比），将 4种溶剂按比例配置于分液漏斗中，充分振荡后静置分层。

1.3.5 HSCCC分离过程

在60 mL流动相中加入3 g样品，充分振荡，使样品完全溶解，注入三通进样阀。将固定相以一定的流速充满色谱柱，然后将柱的首段与三通进样阀相接。开启速度控制器，当转速达到800 r／min时，以2 mL／min的流速泵入流动相，并通过三通进样阀进样。当流动相从色谱柱流出时用部分收集器收集，并采用TLC点样检测分离情况。

1.3.6 分析型高效液相－蒸发光散射（HPLCELSD）分析

色谱柱：Waters Symmetry Cl8（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶水（60∶40）；流速：1.0 mL／min；柱温：25℃；SEDEX75蒸发光检测器参数：载气为空气，漂移管温度70℃，ELSD的增益值为7，压力0.35 MPa。

1.3.7 制备型高效液相（Pre－HPLC）分析

制备柱：ODS－BP－30（250 mm×30 mm，15μm）；流动相：乙腈：水（55：45）；流速：10.0 mL／min；柱温：25℃；进样量：3.0 mL；样品浓度：300 mg／mL。

1.3.8 体外肿瘤细胞增殖抑制试验［15］

采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用。取人结肠癌COLO205细胞和小鼠黑色素瘤B16－F10对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度，每孔100μL细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24 h后给药（100μL／孔），分别设空白对照组和不同浓度药物组（62，125，250，500μg／mL），每组设3个复孔。继续培养72 h后每孔加入 100μL MTT（1 mg／mL，以DMEM培养液溶解），37℃培养2 h，弃去各孔内液体后加入150μL酸化异丙醇（含 0.04 mol／L HCl），避光放置30 min，DG3022A型酶联免疫检测仪测定570 nm处吸光度，计算抑制率。

1.4 数据处理

用SPSS17.0软件将抑制率数据和甘油糖脂处理浓度进行logistic曲线拟合并进行probit转化，计算IC50。

2 结果与讨论

2.1 HSCCC分离溶剂体系选择

为了检查溶剂系统的适用性，需要对分配系数进行测定。本试验采用薄层色谱法（TLC）进行溶剂系统的选择，即根据斑点色度估计样品组分在两相溶剂中的分配情况。虽然TLC法的准确度较低，但方便、快速。按照溶剂系统选择的原则和大量的筛选，得到以下3种溶剂系统。

图1 糖脂在3种溶剂系统中上下相的薄层色谱图

由图1可知，甘油糖脂粗提取物（Fr60）中至少有3种甘油糖脂单体 GCL－I、GCL－II和 GCL－III，即Rf＝0.19，Rf＝0.33，Rf＝0.55。由于不同的甘油糖脂单体所含糖基个数不同，极性差异较大，因此在溶剂系统 A中，GCL－I和 GCL－II主要集中在下相，而GCL－III主要集中在上相，分配系数很不理想。为了使甘油糖脂组分GCLI和GCL－II在溶剂系统上相中有合适的分配，需在溶剂体系A的基础上加入一定量的石油醚溶剂，由于石油醚主要进入下相，使得下相极性变弱，迫使一部分甘油糖脂组分向上相转移，从而得到合适的分配系数。最后，选定系统C作为高速逆流色谱分离的溶剂体系，即氯仿－石油醚－甲醇 －水（5∶2∶6∶4）。

2.2 HSCCC洗脱模式的选择

由于HSCCC允许粗样直接上样分离，有时样品非常复杂，其组分所覆盖的极性范围很宽（如甘油糖脂组分 GCL－I、GCL－II和 GCL－III），采用梯度或等比例洗脱很难实现一次性分离，因此本试验采用双向洗脱模式（dual－mode elution），即第一步采取反向洗脱（上相为固定相，下相为流动相），第二步采取正向洗脱（上相为流动相，下相为固动相）［16］。

2.3 溶剂系统C HSCCC－D1200分离结果

第一步采取反相洗脱，以上相为固定相，下相为流动相。试验条件：氯仿－石油醚－甲醇－水（5∶2∶6∶4），进样量 3.0 g，流动相流速为 2.0 mL／min，转速800 r／min，收集 6 min／tube（15 mL试管），固定相保留率62%。根据TLC结果（图2）可知，通过第一步反向洗脱后，可将甘油糖脂组分GCL－I和GCL－II完全分离开来。合并30～72管和84－134管，旋转蒸发和冷冻干燥后分别得GCL－I（300 mg）和GCL－II（600 mg）。

图2 HSCCC－D1200分离南瓜甘油糖脂的薄层色谱图

第二步采取正向洗脱，即当GCL－I和GCL－II被分离后，将原来的固定相换作流动相，从相反的方向泵入柱中。根据TLC结果（图3）可知，通过第二步正向洗脱后，可将甘油糖脂组分GCL－III分离开来。合并10～56管，旋转蒸发和冷冻干燥后得GCL－III（300 mg）。

图3 HSCCC－D1200分离南瓜甘油糖脂的薄层色谱图

2.4 HPLC制备分离

经高效液相－蒸发光散射（HPLC－ELSD）检测发现，3种甘油糖脂组分 GCL－I、GCL－II和GCL－III并不是单体，它们都分别含有2种化合物，说明这2种化合物结构极其相似，采用HSCCC很难一步将其分离，还需进一步联合制备型HPLC分离。

图4为组分 GCL－I、GCL－II、GCL－III的制备型HPLC分离图谱。收集主峰，减压浓缩至干，最后冷冻干燥，分别得到化合物 1（105 mg）、2（145 mg）、3（250 mg）、4（245 mg）、5（105 mg）和6（120 mg），经HPLC－ELSD测定，纯度均达到98%以上。

图4 GCL－I，GCL－II和GCL－III的制备型HPLC色谱图

2.5 结构鉴定

应用多种波谱学方法（1H NMR，13C NMR，DEPT 90／135，HSQC，HMBC，HR－ESI－MS等），参照文献［17］，确定6个单体化合物分别为二半乳糖亚麻酰甘油（DGMG，18∶3）、二半乳糖亚油酰甘油（DGMG，18∶2）、三半乳糖亚麻酰甘油（TGMG，18∶3）、三半乳糖亚油酰甘油（TGMG，18∶2），四半乳糖亚麻酰甘油（QGMG，18∶3）和 四半乳糖亚油酰甘油（QGMG，18∶2），如图5。

图5 甘油糖脂的结构式

2.6 甘油糖脂的抗肿瘤活性

表1 甘油糖脂对人结肠癌细胞COLO205和小鼠黑色素瘤细胞B16－F10体外增殖抑制效果（IC50）

由表1可以看出，6种甘油糖脂对人结肠癌细胞COLO205和小鼠黑色素瘤细胞B16－F103均有一定的生长抑制作用。构效关系表明，双糖三键甘油糖脂DGMG（18∶3）对人结肠癌 COLO205细胞和小鼠黑色素瘤B16－F10细胞的抗肿瘤活性最强（P＜0.01），其半数抑制浓度 IC50分别为0.052 mg／mL和0.046 mg／mL，TGMG（18∶3）次之，而四糖双键甘油糖脂QGMG（18∶2）抗肿瘤活性最弱，说明甘油糖脂结构组成对其活性有很大的影响，即脂酰基饱和度的不同、糖基数目的不同都会影响到甘油糖脂的抗肿瘤活性。表1数据显示，甘油糖脂抗肿瘤活性随着分子中半乳糖基数目的增多，活性减弱，双糖活性最强，四糖活性较弱；分子中糖基数目一定，抗肿瘤活性随着不饱和程度的增加而提高，如含3个不饱和键的甘油糖脂 DGMG（18∶3）和 TGMG（18∶3）抗肿瘤活性分别强于含2个不饱和键的甘油糖脂DGMG（18∶2）和TGMG（18∶2），这一研究结果与Hou CC等的研究结果相一致。Hou CC等［12］从昭和草中分离得到一种含双亚麻酰基的甘油糖脂dLGG，结构－活性相关性研究证明双亚麻酰基甘油结构部分为重要的活性结构特征，富含dLGG成分的昭和草萃取物较癌症化疗药剂——顺铂更显著抑制小鼠皮肤黑色素肿瘤的生长。

3 结论

本研究采用高速逆流色谱与制备型高效液相相结合的方法，从南瓜中制备出6种高纯度的甘油糖脂单体，该方法制备量大（达到克量级），分离效率高，节约成本（溶剂系统可反复使用），是一种极具潜力的制备方法。抗肿瘤作用的试验研究表明，6种甘油糖脂单体对人结肠癌细胞COLO205和小鼠黑色素瘤细胞B16－F103均有一定的生长抑制作用，其中双糖三键甘油糖脂 DGMG（18∶3）对人结肠癌 COLO205细胞和小鼠黑色素瘤B16－F10细胞的抗肿瘤活性最强，其半数抑制浓度IC50分别为0.052 mg／mL和0.046 mg／mL，TGMG（18∶3）次之，而四糖双键甘油糖脂QGMG（18∶2）抗肿瘤活性最弱。构效关系表明，抗肿瘤能力随着脂酰基不饱和程度的增加而提高，随糖基数目的增加而降低。南瓜中糖苷类化合物作为抗肿瘤药物具有较好的开发前景。需要说明的是，尽管提取过程中使用了大量的对人体有害物质，但将提取物中的有毒的有机溶剂蒸干后，再加入无毒的有机溶剂，比如乙醇，再将乙醇蒸干后，基本上就检不出有毒的有机溶剂残留了，因而不会影响该化合物在食品工业中的应用。

［1］云天海，陈贻诵，邓长智，等.热带地区农家品种南瓜露地节水设施栽培技术［J］.北方园艺，2010（24）：78－79

［2］刘颖，金宏，许志勤.南瓜多糖对糖尿病大鼠血糖和血脂的影响［J］.中国应用生理学杂志，2006，22（3）：83－84

［3］柳红，张静.不同南瓜多糖体外清除羟基自由基作用的研究［J］.武汉植物学研究，2007，25（4）：356－359

［4］Matsufuji M，Nagamatsu Y，Yoshimoto A.Potective effects of bacterial glyceroglycolipid M874B against cell death caused by exposure to heat and hydrogen peroxide［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，89（4）：345－349

［5］Nakata K.High resistance to oxygen radicals and heat is caused by a galactoglycerolipid in Microbacterium sp.M874［J］.The Journal of Biochemistry，2000，127（5）：731－737

［6］Nakata K，Guo C T，Matsufuji M，et al.Influenza a virusbinding activity of glycoglycerolipids of aquatic bacteria［J］.Journal of Biochemistry（Tokyo），2000，127（2）：191－198

［7］Berge JP，Debiton E，Dumay J，et al.In vitro anti－inflammatory and anti－proliferative activity of sulfolipids from the red alga Porphyridium cruentum［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50：6227－6232

［8］Larsen E，Kharazmi A，Christensen L P，et al.An antiinflammatory galactolipid from rose hip（Rosa canina）that inhibits chemotaxis of human peripheral blood neutrophils in vitro［J］.Journal of Natural Products，2003，66（7）：994－995

［9］Bruno A，Rossi C，Marcolongo G，et al.Selective in vivo anti－inflammatory action of the galactolipid monogalactosyldiacylglycerol［J］.European Journal of Pharmacology，2005，524：159－168

［10］Maeda N，Hada T，Murakami－Nakai C，et al.Effects of DNA polymerase inhibitory and antitumor activities of lipase－hydrolyzed glycolipid fractions from spinach［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16（2）：121－128

［11］Perez Gutierrez R M，Lule P R.Cytotoxic constituents from daphnia pulex［J］.Pharmaceutical Biology，2005，43（4）：313－316

［12］Hou CC，Chen Y P，Wu J H，et al.A galactolipid possesses novel cancer chemopreventive effects by suppressing inflammatory mediators and mouse B16 melanoma［J］.Cancer Research，2007，67（14）：6907－6915

［13］王辉，李药兰，沈伟哉，等.硫酸甘油糖脂体外抑制肿瘤细胞增殖活性的研究［J］.暨南大学学报：医学版，2007，28（2）：136－141

［14］Nakae T，Kometani T，Nishimura T，et al.Preparation of glyceroglycolipids from pumpkin and their effects on polymorphic transformation of cocoa butter.Food Science and Technology Research，2000，6（4）：263－268

［15］王雪玲，缪莉，董昆明，等.海洋细菌抗肿瘤活性菌株的筛选与鉴定［J］.扬州大学学报：农业与生命科学版，2012，33（2）：18－22

［16］曹学丽.高速逆流色谱分离技术及应用［M］.北京：化学工业出版社，2005：48－49

［17］ZHA Zha－jun，YUE Jian－min.New glyceroglycolipid and ceramide from Premna microphylla［J］.Lipids，2003，38（12）：1299－1303.