谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量测定方法的比较

李亚平， 玉崧成， 于 斐， 吴拥军， 张洪权

(1．郑州大学公共卫生学院 河南郑州450001;2．郑州大学化学与分子工程学院 河南郑州450001)

0 引言

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是全球性污染谷物的霉菌毒素之一，大量存在于小麦、玉米等谷物以及谷物类制品中［1］．DON能引起食欲下降、器官损伤、代谢紊乱以及生长抑制等症状［2－3］，对免疫功能以及神经元结构功能产生明显的影响［4］．另外还具有致畸、胚胎毒性，可能是一种潜在的致癌物质［5－7］．DON的危害已引起不少国家的重视，我国的国家标准GB 2761—2011(食品中真菌毒素限量)中规定谷物及其制品中的DON最高限量为1 mg/kg．目前测定谷物中DON常用的方法主要包括薄层色谱［8］、酶联免疫［9］、气相色谱［10］、液相色谱［11］以及色谱与质谱联用技术等［12－14］．我国食品中 DON 的测定为免疫亲和层析净化高效液相色谱法(GB/T 23503—2009)，谷物及其制品中DON的测定为薄层色谱测定方法及免疫测定方法(GB/T 5009．111—2003)．作者建立了测定DON含量的ELISA和HPLC法，并对这两种方法进行了方法学比较．

1 材料与方法

1．1 主要试剂与仪器

DON单克隆抗体(Envirlogix);DON标准品(Sigma公司);HRP标记羊抗鼠IgG二抗(上海佑隆生物科技有限公司);显色剂A、显色剂B(河南华美生物公司);呕吐毒素免疫层析亲和柱(北京华安麦科生物技术有限公司);其他试剂均为分析纯．

高效液相色谱仪系统(美国戴安公司);酶标仪(WELLSCAN MK3，Thermo);UV-1606紫外分光光度仪(日本岛津);FW-100型高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司);快速混匀器(XK96-A，姜堰市新康医疗机械有限公司)．

1．2 间接竞争ELISA法

(1)一抗、二抗稀释液和封闭液的考察 以引入无关蛋白尽可能少的原则，对1%OVA的PBS、1．25%OVA的CB、0．02%BSA的PBS和10%NBS的PBS这四种常用一抗、二抗稀释液和封闭液优化，根据吸光度的大小选择1%OVA的PBS作为一抗、二抗稀释液和封闭液．

(2)抗体和包被抗原工作浓度的考察 分别将抗体和包被抗原进行倍比稀释，通过竞争棋盘滴定实验，选择抗体最佳浓度12 μg/mL、包被抗原1∶8稀释为最佳条件．

(3)最佳实验条件的考察 通过正交试验对最佳包被条件、一抗及二抗孵育时间进行考察，选择对抗原结合反应抑制率高、吸光度大、适合快速检测的组合．最终选取包被条件是4℃过夜(12 h)，一抗最佳孵育时间是60 min，二抗最佳孵育时间是60 min．

(4)样品前处理 将待测玉米(小麦)样品用高速万能粉碎机粉碎，过300目的分子筛，用四分法称取5 g通过分子筛的待测样品于250 mL锥形瓶中，加入25 mL 10%的乙腈－水提取液．置于快速混匀器上震荡10 min，过滤，收集滤液．取适量滤液或其稀释液进行ELISA检测分析．

(5)标准曲线的绘制 配制一系列质量浓度为10、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL 的 DON，以 DON质量浓度的对数log C为横坐标(x)，以DON标准样品各浓度孔的吸光度为纵坐标(y)，绘制标准曲线．

1．3HPLC 法

(1)色谱条件 参照GB/T 23503—2009食品中DON的测定(免疫亲和层析净化高效液相色谱法)，选择色谱实验条件如下:色谱柱为Agilent XDB－C18柱(5 μm，4．6 mm×250 mm);流动相为甲醇－水(体积比20∶80);流速为0．8 mL/min;柱温为35℃;进样量为20 μL;检测波长为218 nm;检测器为紫外检测器．

(2)样品前处理 将待测玉米(小麦)样品用高速万能粉碎机粉碎，过300目的分子筛，用四分法称取25 g通过分子筛的待测样品于100 mL容量瓶中，加入5 g聚乙二醇8 000，用水定容至刻度线．置于快速混匀器上震荡10 min，过滤至滤液澄清，收集滤液．

(3)样品滤液的净化与洗脱 准确移取滤液2．0 mL，参照DON免疫亲和柱说明书进行净化、洗脱．收集全部洗脱液用于HPLC检测分析．

(4)标准曲线的绘制 用流动相稀释 DON 标准品母液至质量浓度分别为0．1、0．2、0．5、1．0、2．0和5．0 μg/mL的标准工作液，以DON标准工作液质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线．

2 结果与分析

2．1 间接竞争ELISA法的方法学考察

(1)线性回归方程 在10～1 000 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y=－0．332 9x+2．750 7，相关系数 r= －0．981 3．

(2)灵敏度 测定阴性孔10次，计算阴性孔平均值(A阴)及标准方差(SD)，根据公式A=A阴－2SD，计算出分析检测限为 0．043 μg/mL．

(3)实际样品的准确度及精密度 分别向经前处理且其含量已知的小麦和玉米样品中添加一定质量浓度的DON标准品，配成高、中、低三个质量浓度，每个质量浓度测定6次，结果如表1所示．玉米的平均回收率为96．8%，RSD的平均值为8．8%;小麦的平均回收率为97．3%，RSD的平均值为4．4%．

表1 ELISA法的回收率结果(n=6)Tab．1 Results of recoveries by ELISA

2．2 HPLC法的方法学考察

(1)线性回归方程 在0．1～5 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y=0．570 1x+0．036 4，相关系数 r=0．998 7．

(2)灵敏度 将DON标准品母液逐级稀释，直到信号值与噪音值之比为3∶1时，确定此时信号值对应的质量浓度即为HPLC法的检测限．实验测定的DON检测限为0．1 μg/mL．

(3)实际样品的准确度及精密度 分别向经前处理且其含量已知的小麦和玉米样品中添加一定质量浓度的DON标准品，配成高、中、低三个质量浓度，每个质量浓度测定6次，结果如表2所示．玉米的平均回收率为92．7%，RSD的平均值为6．8%;小麦的平均回收率为92．7%，RSD的平均值为3．1%．

表2 HPLC法的回收率结果(n=6)Tab．2 Results of recoveries by HPLC

2．3 两种检测方法测定结果的比较

(1)灵敏度比较 ELISA 法的检测限为0．043 μg/mL，HPLC 法的检测限为0．1 μg/mL．由此可知，ELISA法检测限低，灵敏度高．

(2)准确度比较 由表1和表2可知，ELISA法对实际样品的回收率较好，准确度高．相对而言HPLC法回收率低，准确度低，这可能与HPLC法前处理的复杂程序有关．

(3)精密度比较 将两种方法高、中、低三个质量浓度RSD的平均值进行方法学的比较，可知两种方法的精密度没有显著性差异．

3 结论

由ELISA和HPLC方法学数据比较得出，ELISA法简便快速，其灵敏度高于HPLC法，能够对谷物类粮食中的微量DON进行监测．ELISA法回收率高，这可能是由于HPLC前处理极其复杂，处理过程会造成待测毒素一定程度的损失，从而造成HPLC法回收率偏低．ELISA和HPLC法的精密度没有显著性差异，在实验中都可以通过更加规范化的操作来提高精密度．

综上可知，ELISA法不需要繁杂的前处理，可以批量快速检测，且具有高灵敏度和准确度．HPLC样品前处理过程复杂，需要专业人员操作，所需设备昂贵．所以ELISA法在现场快速检测谷物中DON含量方面更具有优势．

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