砷暴露对肝脏、肾脏氧化损害的研究进展

钟源霞，孙文长

(大连医科大学 微生物学教研室，辽宁 大连116044)

1 砷污染简介

砷污染已成为一种重要的环境危险因素，许多国家和地区已有砷污染的报道，如印度、孟加拉、中国、美国、智利、墨西哥等［1-5］。2001年世界卫生组织将饮用水允许的砷含量由原先的50 μg/L 降为10 μg/L［6］，全球70 个国家230 多个地区遭受砷污染，5 000 多万人口饮用水砷浓度超过50 μg/L，1 亿4 000 万人口饮用水砷浓度超过10 μg/L［7］。我国砷污染问题同样非常严重，560 万人口饮用水砷含量超过50 μg/L，1 500 万人口饮用水砷含量超过10 μg/L，仅次于孟加拉和印度［7］。

1.1 砷的来源和暴露途径

砷在自然界中分布十分广泛。引起砷污染的主要来源是地质中的砷渗入到地下水引起的饮用水污染。砷在工业中的应用是砷污染的另一个来源。砷化镓或铝砷化镓晶体是半导体元件的材料，在提炼和使用这些晶体过程中会造成工业污染［8］。砷的硫化物被用作杀虫剂，造成了环境污染［9］。目前As2O3广泛应用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，某些民族医学中也使用含砷药物，因此药用砷是砷污染的又一来源［10-11］。

砷的主要暴露途径是经口摄入，如饮用砷污染的水，摄取砷污染的食物。其次是经呼吸道吸收，如冶金和化工厂工人吸入空气中的含砷粉尘。

1.2 砷的代谢

口服摄入砷的吸收主要发生在小肠。多数以三价无机砷形式通过简单扩散方式进入细胞。少数以五价砷形式进入细胞，随后还原为三价砷。砷化合物包括无机砷和有机砷，无机砷毒性往往远高于有机砷。无机砷主要在肝脏中进行生物转化，少数在肺和肾脏中进行，最终生成低毒性的五价有机砷，如单甲基化砷酸盐［monomethylarsonic acid，MMA(V)］和双甲基化砷酸盐［dimethylarsinic acid，DMA(V)］，并通过尿液排出体外。通常砷的排出比较迅速，可以在几天内排出体外，也有的在体内滞留数月甚至更长时间［1］。

1.3 砷的致病性

急性砷中毒主要是误食杀虫剂及自杀等引起的，主要表现为恶心、呕吐、腹泻、腹绞痛等胃肠道症状，也可有心肌毒性、肾脏衰竭、呼吸衰竭等表现，严重的可导致死亡。慢性砷暴露可以导致机体多器官损伤，造成皮肤、心血管、肝脏、胃肠道、生殖系统及神经系统的相关疾病。其中以皮肤角质化、色素沉着最为常见。在肝脏可以引起纤维化、甚至肝硬化。儿童的智力和语言能力都受到影响［2，4，12-14］。流行病学调查显示饮用高砷水与人类皮肤癌、膀胱癌、肝癌、肾癌和肺癌等的发病率增加有关［1］。

2 砷的毒性机制

目前研究认为:砷暴露增加体内活性氧和活性氮的生成，导致氧化应激。增加的活性氧有过氧自由基(ROO·)，超氧阴离子(O2·–)、单线态氧(1O2)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)和二甲基砷自由基［(CH3)2As·］等［1］。氧化应激造成细胞膜和蛋白质损伤，表现为脂质过氧化和蛋白质羰基含量的增加。有研究表明:砷可抑制线粒体呼吸链中复合物的活性导致自由基的大量产生［15］。自由基可与DNA 碱基反应，生成8 -羟基-脱氧鸟苷(8 - hydroxydeoxyguanosine)、8 - 氧代- 脱氧鸟苷(8 - Oxo - deoxyguanosine)［1］，造成DNA 的损伤。损伤的DNA 长期积累可引起突变，最终导致肿瘤。

砷还可抑制线粒体丙酮酸脱氢酶的活性，减少细胞内乙酰辅酶A 的生成，影响三羧酸循环，造成细胞内ATP 的产生下降。三价砷易与巯基结合，抑制细胞内许多含巯基酶和代谢物的活性，尤其抑制抗氧化剂谷胱甘肽的生成。五价砷在体内可转化为三价砷，产生毒性效应。并且由于砷的电子结构和原子半径与磷类似，其化学性质也相似，在体内糖酵解和细胞呼吸过程中，五价无机砷替代磷酸盐参与高能磷酸键的形成，使氧化磷酸化解偶联，减少ATP的生成［1］。

砷进入体内经甲基化通过尿液排出体外，目前认为甲基化是砷的解毒机制。但最近研究发现:三价中间体—MMA(III)和DMA(III)具有较高的反应活性和致癌性［1］。

体内的抗氧化酶和抗氧化代谢物是机体抵抗氧化应激的第一道和第二道防线。砷诱导的氧化应激显著降低细胞内抗氧化酶的活性，如:超氧物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽- S - 转移酶(glutathione - S -transferase，GST)、谷胱甘肽氧化酶(glutathione oxidase，GPx)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)和葡萄糖-6 -磷酸脱氢酶(glucose -6 -phosphate dehydrogenase，G -6 -PD)等，降低抗氧化代谢物水平，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)和总硫醇，并增加氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide，GSSG)含量［16］。

3 砷毒性的防治

目前砷毒性的防治主要有螯合剂疗法和抗氧化剂疗法。

螯合剂疗法是应用英国抗路易士药剂(British anti-lewisite)与砷螯合，降低砷的毒性，加速砷的排出。这主要用于急性砷中毒治疗［9，17］。

抗氧化剂可以恢复失衡的氧化还原系统，保护细胞的形态及活性，降低细胞内活性氧的生成等。治疗证明有效的抗氧化剂主要有维生素C、维生素E 和牛磺酸等。砷暴露大鼠同时补充维生素C 或维生素E，可有效降低肝脏和肾脏组织中过氧化物的水平［18］。还可以抑制砷诱导的肿瘤坏死因子- α(tumor necrosis factor -alpha，TNF -α)水平升高及caspase-3 的激活［19］。在慢性砷暴露大鼠中，维生素C 可以降低血清中转氨酶活性，恢复受损的SOD等抗氧化酶活性［20］。牛磺酸是一种L -半胱氨酸的代谢终产物，在许多组织中大量存在。它可以保护人体许多器官免受各种有毒物质造成的毒性和氧化应激损伤。亚砷酸钠暴露(3 mg/kg，口服，3 周)前5 天补充牛磺酸(100 mg/kg·d)，可防止砷诱导的大鼠肾功能不全、减少活性氧和一氧化氮的产生、抑制细胞凋亡［16］。还有研究显示:牛磺酸可以减轻砷诱导的DNA 损伤［21］。硫辛酸是近年来广受关注的抗氧化剂，广泛分布于细胞膜，细胞质和细胞外空间。硫辛酸一方面可直接清除·OH、次氯酸和1O2，另一方面可使细胞内的抗氧化剂再生，如GSH、维生素C 和维生素E 等，在生物系统中发挥重要的抗氧化作用。此外，硫辛酸既具有水溶性又具有脂溶性，可以跨越血-脑屏障。目前临床上已将硫辛酸用于糖尿病神经损伤的防治［22-23］。Kokilavani等［24］表明:硫辛酸降低砷暴露后肝脏和肾脏中活性氧的产生，降低砷暴露后脂质过氧化物水平，提高砷暴露后抗氧化酶和抗氧化代谢物的水平，对砷暴露造成的损伤具有保护作用。

目前慢性砷中毒的治疗非常有限，行之有效的方法是提供安全的饮用水及应用抗氧化剂［17］。

4 砷对肝脏损害的实验研究

肝脏拥有门静脉和肝动脉两套血液供应，无论是消化道吸收的化学毒物还是其他途径进入机体的化学毒物都可经血液循环迅速达到肝脏，负责人体物质与能量代谢的同时，也是化学毒物进行生物转化的主要器官，极易受到化学物质的损害［25］。

Ghatak 等［26］的研究显示，砷暴露12 个月，小鼠肝脏表现出了脂肪变性、纤维化等较为严重的病理现象，与人类砷暴露后的肝损害较为类似。

Das 等［27］研究表明:25 mg/L 亚砷酸钠饮用水暴露6 个月，大鼠可造成明显的肝细胞变性和血清丙氨酸氨基转移酶活性的显著增加。在该模型中，氧化应激的指标:GSH 水平下降，GSSG 和脂质过氧化物含量增加，抗氧化酶(CAT、SOD)等活性下降，表明砷诱导肝脏产生氧化损伤。细胞实验表明:砷暴露降低肝细胞的细胞活性，且有剂量依赖效应。砷暴露的肝细胞表现出线粒体膜电势降低，线粒体细胞色素c 水平下降，胞浆细胞色素c 增加。同时砷暴露肝细胞还表现出ATP 水平的显著降低。流式细胞术、DNA 凝胶电泳等方法显示:砷暴露导致肝细胞的大量凋亡，正常细胞凋亡率几乎为零，而砷暴露细胞为55.23%。免疫印迹显示:亚砷酸钠上调促凋亡蛋白(Bad、Bax)的表达，下调抗细胞凋亡蛋白(Bcl-2、BcL -xL)的表达。同时，亚砷酸钠显著增加肝脏中PKCδ 的表达，而不影响其他两个主要的蛋白激酶C 亚型(PKCα 和PKCζ)的表达。应用PKCδ 的抑制剂(rottlerin)预处理肝细胞可减少砷诱导的磷酸化的PKCδ，显著增加细胞活性。PKCδ 抑制剂的应用也可抑制砷诱导的JNK 的增加，提示PKCδ 在JNK 的上游。实验还显示牛磺酸可阻断PKCδ 的活化，抑制细胞凋亡。总之，该研究提示砷可以直接作用于线粒体;抗氧化剂牛磺酸可以显著改善砷的肝毒性作用。Singh 等［28］应用As2O3口服大鼠模型也观察到砷暴露导致的肝脏损伤，该损伤可通过补充维生素C 得以有效的改善，进一步证实氧化损伤是砷毒性的重要机制。

Nrf2 是一种转录因子，在砷诱导的毒性中起保护作用。1 mg/L 亚砷酸钠饮用水方式暴露6 周的Nrf2 + / + 小鼠表现为肝细胞空泡化变性，而Nrf2 - / -小鼠中则表现为肝脏坏死，并伴随着巨噬细胞和淋巴细胞浸润。10 mg/L 和100 mg/L 砷引起Nrf2 + / +小鼠肝脏坏死。然而，相同剂量的砷则引起Nrf2 - / -小鼠更严重的坏死和炎性细胞浸润。这些浸润的炎性细胞含有嗜酸性粒细胞，而嗜酸性粒细胞的浸润与脂肪肝和肝纤维化相关［29］。该研究提示砷暴露激活Nrf2 依赖的抗氧化反应，上调某些抗氧化酶的表达，如GST。但当砷毒性作用过强时，超出机体负荷，则造成明显的损害。Nrf2 的保护作用在细胞水平上也得到了证实。

5 砷对肾脏损害的实验研究

肾脏是机体的排泄器官，排出体内的代谢废物，同时调节体液、电解质及酸碱平衡。代谢废物或有毒物质在肾小球中滤过后又在肾小管重吸收，使毒物浓缩或沉积在肾小管中［25］。

亚砷酸钠(3 mg/kg)口服作用于Wistar 雄性大鼠3 周可造成肾脏损伤。血液检测显示尿素氮和肌酐水平上升;组织学检查显示肾脏有多位点出血，坏死和肾小管水肿［16］。砷暴露导致肾组织中活性氧的生成显著高于正常对照，一氧化氮的产生也有增加。同时砷暴露增加肾脏丙二醛、蛋白质羰基等的含量，降低肾脏中抗氧化酶(SOD，CAT，GST，GR，GPX 和G6PD)的活性，提高肾脏中磷酸化p38、磷酸化ERK1/2 及NF -κB(P65)的表达。砷暴露引起的损伤部分依赖细胞线粒体的损伤，降低了大鼠肾脏线粒体膜电势，提高了胞浆细胞色素c 的浓度。牛磺酸对该肾脏损伤有保护作用［16］。砷还可引起肾脏的DNA 损伤，牛磺酸和维生素C 显示出保护作用［21］。维生素E、硫辛酸对砷暴露造成的肾脏损伤也具有保护作用［18，24］这些都显示砷的毒性机理为氧化损伤。

总之，砷暴露可以引起机体多脏器损伤，砷的毒性机理目前认为是砷诱导机体生成氧化损伤。砷中毒的防治主要是应用螯合剂和抗氧化剂。随着砷损伤机理的进一步研究，新的防治措施会给患者带来更大的益处。

［1］ Jomova K，Jenisova Z，Feszterova M，et al. Arsenic:toxicity，oxidative stress and human disease［J］. J Appl Toxicol，2011，31(2):95 -107.

［2］ Kapaj S，Peterson H，Liber K，et al. Human health effects from chronic arsenic poisoning - a review［J］. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng，2006，41(10):2399 -2428.

［3］ Tapio S，Grosche B. Arsenic in the aetiology of cancer［J］. Mutat Res，2006，612(3):215 -246.

［4］ Yoshida T，Yamauchi H，Fan Sun G. Chronic health effects in people exposed to arsenic via the drinking water:dose-response relationships in review［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2004，198(3):243 -252.

［5］ Marshall G，Ferreccio C，Yuan Y，et al. Fifty-year study of lung and bladder cancer mortality in Chile related to arsenic in drinking water［J］. J Natl Cancer Inst，2007，99(12):920 -928.

［6］ World Health Organization(WHO). Guidelines for drinking water quality［M］. 2nd. WHO Geneva，2001:41 -42.

［7］ Ravenscroft P，Brammer H，Richards KS. Scale and Impact of Arsenic Pollution. Arsenic pollution:a global synthesis［M］. U.K:Wiley- Blackwell，2009:492 -503.

［8］ Chen HW. Exposure and health risk of gallium，indium，and arsenic from semiconductor manufacturing industry workers［J］. Bull Environ Contam Toxicol，2007，78(2):123 -127.

［9］ Stephanopoulos DE，Willman DA，Shevlin D，et al. Treatment and toxicokinetics of acute pediatric arsenic ingestion:danger of arsenic insecticides in children［J］. Pediatr Crit Care Med，2002，3(1):74 -80.

［10］ Wang ZY，Chen Z. Acute promyelocytic leukemia:from highly fatal to highly curable［J］. Blood，2008，111(5):2505 -2515.

［11］ Shen ZX，Chen GQ，Ni JH，et al. Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia(APL):II. Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsed patients［J］. Blood，1997，89(9):3354 -3360.

［12］ Calder n J，Navarro ME，Jimenez-Capdeville ME，et al.Exposure to arsenic and lead and neuropsychological development in Mexican children［J］. Environ Res，2001，85(2):69 -76.

［13］ Wasserman GA，Liu X，Parvez F，et al. Water arsenic exposure and children＇s intellectual function in Araihazar，Bangladesh［J］. Environ Health Perspect，2004，112(13):1329 -1333.

［14］ Wasserman GA，Liu X，Parvez F，et al. Arsenic and manganese exposure and children＇s intellectual function［J］. Neurotoxicology，2011，32(4):450 -457.

［15］ Naranmandura H，Xu S，Sawata T，et al. Mitochondria are the main target organelle for trivalent monomethylarsonous acid (MMA(III))- induced cytotoxicity［J］.Chem Res Toxicol，2011，24(7):1094 -1103.

［16］ Roy A，Manna P，Sil PC. Prophylactic role of taurine on arsenic mediated oxidative renal dysfunction via MAPKs/NF-kappaB and mitochondria dependent pathways［J］.Free Radic Res，2009，43(10):995 -1007.

［17］ Ratnaike RN. Acute and chronic arsenic toxicity［J］.Postgrad Med J，2003，79(933):391 -396.

［18］ Ramanathan K，Shila S，Kumaran S，et al. Protective role of ascorbic acid and alpha -tocopherol on arsenic -induced microsomal dysfunctions［J］. Hum Exp Toxicol，2003，22(3):129 -136.

［19］ Ramanathan K，Anusuyadevi M，Shila S，et al. Ascorbic acid and alpha- tocopherol as potent modulators of apoptosis on arsenic induced toxicity in rats［J］. Toxicol Lett，2005，156(2):297 -306.

［20］ Rana T，Bera AK，Das S，et al. Effect of ascorbic acid on blood oxidative stress in experimental chronic arsenicosis in rodents［J］. Food Chem Toxicol，2010，48(4):1072 -1077.

［21］ Li Z，Piao F，Liu S，et al. Preventive effects of taurine and vitamin C on renal DNA damage of mice exposed to arsenic［J］. J Occup Health，2009，51(2):169 -172.

［22］ Ghibu S，Richard C，Vergely C，et al. Antioxidant properties of an endogenous thiol:Alpha -lipoic acid，useful in the prevention of cardiovascular diseases［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2009，54(5):391 -398.

［23］ Smith AR，Shenvi SV，Widlansky M，et al. Lipoic acid as a potential therapy for chronic diseases associated with oxidative stress［J］. Curr Med Chem，2004，11 (9):1135 -1146.

［24］ Kokilavani V，Devi MA，Sivarajan K，et al. Combined efficacies of DL-alpha-lipoic acid and meso 2，3 dimercaptosuccinic acid against arsenic induced toxicity in antioxidant systems of rats［J］. Toxicol Lett，2005，160(1):1 -7.

［25］ 王心如. 毒理学基础［M］. 第5 版. 北京:人民卫生出版社，2008:361 -390.

［26］ Ghatak S，Biswas A，Dhali GK，et al. Oxidative stress and hepatic stellate cell activation are key events in arsenic induced liver fibrosis in mice［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，251(1):59 -69.

［27］ Das J，Ghosh J，Manna P，et al. Protective role of taurine against arsenic-induced mitochondria-dependent hepatic apoptosis via the inhibition of PKCdelta -JNK pathway［J］. PLoS One，2010，5(9):e12602.

［28］ Singh S，Rana SV. Ascorbic acid improves mitochondrial function in liver of arsenic - treated rat［J］. Toxicol Ind Health，2010，26(5):265 -272.

［29］ Jiang T，Huang Z，Chan JY，et al. Nrf2 protects against As(III)- induced damage in mouse liver and bladder［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，240(1):8 -14.