钙网蛋白介导热处理对大鼠骨骼肌适应性变化钙调机制的研究*

李焕春，肖国强

（华南师范大学体育科学学院民族体质与健康研究中心，广东广州510631）

高温刺激可诱导生物体产生应激反应，使机体产生应激抵抗，提高保护力。研究表明，热应激可以增强心肌细胞抵抗致损伤因素影响，有效减轻心肌冠脉阻塞和再灌注损伤减轻［1］，并且这种现象也出现在骨骼肌组织中［2，3］。这种热环境下发生的应激反应是一种全身性的综合生理反应，主要通过产生应激蛋白，让机体在一定时间内获得适应性保护，以抵抗不利因素的影响。研究表明，机体Ca2＋反常是一切组织细胞损伤的共同途径［4］，组织细胞的损伤与Ca2＋变化密切相关，因此推测高温诱导产生的适应性保护可能与机体内钙调节有关。钙网蛋白（cal-reticulin，CRT）是一种应激性的钙结合蛋白，主要参与细胞内钙稳定性调节，由于钙网蛋白为应激性的蛋白，热刺激诱导产生的适应性保护，可能与钙网蛋白的产生有关，但目前国外钙与热应激适应保护之间的研究非常少，国内尚未见报道，由于运动引起的细胞内Ca2＋浓度的变化是运动性骨骼肌损伤的发生的重要机制，因此本实验试图研究高温环境处理后大鼠骨骼肌肌质网钙网蛋白的变化，探讨钙网蛋白与肌质网、线粒体钙及钙酶的变化，从钙调机制的角度阐明热处理产生的适应性保护现象，为热处理在运动医学中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

40只体重（140．25±12．34）g清洁级雄性 SD大鼠购自南方医科大学实验动物中心，在清洁级动物房（温度为（22±0．3）℃，湿度 50%～60%）喂养 3 d后随机分成安静对照组组（C）8只和热处理组32只，所有大鼠自由进食，饮水。热处理组按照热干预后的时间再分成热处理即刻组（H1）、热处理后24 h组（H2）、热处理后 48 h组（H3）和热处理后 6 d组（H4）（n＝8）。线粒体提取试剂盒和内质网提取试剂盒由上海Genmed有限公司购买，线粒体和内质网Ca2＋含量及Ca2＋-ATP酶活性测试试剂盒由南京建成生物有限公司购买，CRT抗体由 Santa Cruz Biotechnology公司购买。

1．2 实验方法

在一个封闭的桑拿环境中对大鼠进行非麻醉状态下的热处理，以避免大鼠受其他刺激的影响。大鼠共进行4个周期的热处理，热干预方式参照其他热刺激形式而设立［5］。整个热处理期间，湿度控制在50%左右，并监控大鼠肛温。热处理4 d为一个周期，3 d热干预，1 d休息。一共4个周期，热处理温度依次递增，监测大鼠直肠温度达到预期值以后维持15 min，每个周期间大鼠直肠要达到的预值温度为（39±0．5）℃、（39．5±0．5）℃、（40．5±0．5）℃及（41．5±0．5）℃。每次热处理时间约为 30～35 min，热处理期间，严格控制温度和湿度，并观察大鼠行为。

1．3 指标测试

热处理完毕后，对大鼠进行宰杀。采用7%水合氯醛（0．4 ml／100 g bw）腹腔注射麻醉。腹主动脉取血置于抗凝管，并离心分离血清后放入-70℃冰箱中保存。取腓肠肌进行分离，并用4℃生理盐水清洗后，留液氮中保存待用。采用线粒体和内质网提取试剂盒分别对大鼠骨骼肌中的线粒体和内质网进行提取，提取时严格按照试剂盒操作流程进行。采用甲基百里香酚蓝（MTB）比色法和化学比色法分别测定线粒体和内质网中的Ca2＋含量及Ca2＋-ATP酶活性，蛋白免疫印迹 Westen Blot检测 CRT，对 CRT蛋白条带采用Image-proplus软件进行分析，并计算CRT蛋白条带积分吸光度值（integrated absorbance，IA＝平均吸光度值×面积），用CRT的IA与β-actin IA的比值来衡量其相对水平。

1．4 数据统计

实验数据采用SPSS 10．0软件包处理，实验结果以均数±标准差（¯x±s）表示，采用两样本均数 t检验分析。

2 结果

2．1 热处理对大鼠骨骼肌肌质网及线粒体Ca2＋-ATP酶活性的影响

热处理完成后，以 H2组大鼠骨骼肌肌质网Ca2＋-ATP酶活性值最高，与安静对照组C比较呈非常显著性（P＜0．01），而 H1组与安静对照组 C比较，其值也呈显著性差异（P＜0．05）；线粒体 Ca2＋-ATP酶活性以H1组最高，与安静对照组C比较呈显著性差异（P＜0．05，表 1）。

Tab．1 Ca2＋-ATP activity comparison of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmolPi／（mg pro·h），±s，n＝8）

Tab．1 Ca2＋-ATP activity comparison of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmolPi／（mg pro·h），±s，n＝8）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs Cgroup

Group Sarcoplasmic reticulum Mitochondrial C 4．12±0．86 18．03±1．24 H1 6．40±1．29* 27．04±1．76*H2 7．56±0．25** 19．16±2．34 H3 4．78±0．62 18．23±2．31 H4 4．36±0．57 18．18±0．65

2．2 热处理对大鼠骨骼肌肌质网及线粒体Ca2＋浓度的影响

热处理完成后，大鼠骨骼肌肌质网Ca2＋浓度以H2组最高，H1组其次，两者与安静对照组比较呈显著性差异（P＜0．05）；线粒体 Ca2＋浓度 H1与 H2组值虽高于安静对照组C，H3及H4组值虽低于安静对照组C，也没有著差异性（表2）。

Tab．1 Effect of Ca2＋concentration of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmol／g pro，±s，n＝8）

Tab．1 Effect of Ca2＋concentration of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmol／g pro，±s，n＝8）

*P＜0．05 vs Cgroup

Group Sarcoplasmic reticulum Mitochondrial C 64．23±3．14 147．12±32．21 H1 78．56±4．59 154．45±40．30 H2 80．45±6．08* 148．33±21．57 H3 66．15±4．21 146．40±23．18 H4 65．12±0．32 146．51．03±20．24

2．3 热处理对大鼠骨骼肌应激性钙网蛋白CRT产表达的影响

热处理完毕后，H1、H2、H3组大鼠骨骼肌中应激蛋白CRT的表达量较安静对照组C显著增加，之后出现表达下调（图1）。

Fig．1 Effect of heat treatment on CRT protein expression A：Western blot of CRT andβ-actin；B：Statistic analysis of band relative intensity**P＜0．01 vs control group

3 讨论

动物机体在受热刺激时可发生热应激反应，并产生热适应，提高细胞抗损伤能力。研究表明，机体在热应激状态下，主要通过机体内产生的N0、活性氧等相关物质，启动复杂的细胞信号转导机制，在机体内产生相应的热休克反应，诱导合成应激蛋白，来发挥保护作用［6］，这种保护性的应激蛋白普遍存在于骨骼肌、心肌、肝、肾和脑等多种组织、器官和细胞中，在细胞水平上可逆地调节对刺激的敏感性［7］，提高抗损伤能力，以保持机体的适应性。Ca2＋是机体内重要的生物信号传导因子，同时参与骨骼肌的收缩与舒张。细胞中的Ca2＋主要集中在线粒体和肌质网中，其浓度的稳定依赖于线粒体和肌质网的调节。肌肉收缩时，肌质网释放Ca2＋进入胞浆，造成胞浆中Ca2＋浓度急剧升高，肌肉舒张时，肌质网通过膜上Ca2＋-ATP酶参与主动摄取 Ca2＋，线粒体对钙的调节也是通过膜上的Ca2＋-ATP酶来完成，在细胞浆游离钙浓度急剧上升时，线粒体会摄取聚集在胞浆内多余的钙，因此骨骼肌肌质网、线粒体膜Ca2＋-ATP酶活性变化，也直接影响到骨骼肌的收缩舒张功能。组织细胞的损伤与Ca2＋浓度的变化密切相关，细胞质肌网钙摄取能力的下降，细胞线粒体内钙的堆积是造成细胞损伤的重要原因，热刺激产生的热适应与抗损伤能力可能与钙的调节有关，应激状态下骨骼肌细胞内钙调机制的适应性变化非常重要，这种变化直接影响到骨骼肌的正常生理机能。本实验结果显示，热处理后骨骼肌肌质网H2组Ca2＋浓度最高，H1组其次，且与对照组比较呈显著性差异，H3和H4组的值虽然高于安静组对照组C，但没有显著性差异。对于细胞内线粒体Ca2＋来说，H1与H2组的值高于安静对照组C，而H3，H4组的值低于安静对照组C，表明经过一段时间的热刺激后，大鼠骨骼肌细胞内Ca2＋的分布发生了变化，钙流的重新分布可能为细胞产生保护性适应提供生理基础，以抵抗机体的抗损伤能力。同时由于骨骼肌肌质网、线粒体对钙的调节与其膜上Ca2＋-ATP酶活性变化直接有关，因此Ca2＋-ATP酶也会发生适应性的变化以满足对钙调节。实验结果表明，热处理后肌质网膜上Ca2＋-ATP酶活性以H2组最高，与安静对照组 C比较呈非常显著性，且 H1、H3及 H4组Ca2＋-ATP酶活性的值都比安静对照组C时要高，其中H1组值与对照组呈显著性差异。线粒体膜上Ca2＋-ATP酶活性的变化，以H1组Ca2＋-ATP酶的值最高，与安静对照组C比较呈显著性差异。结果表明大鼠经一段时间的热刺激以后，提高了细胞内膜Ca2＋-ATP活性，增强了骨骼肌肌质网、线粒体摄取钙的能力，有利于机体Ca2＋稳定的调节，因此推测热处理诱导刺激产生的保护性现象可能与细胞内线粒体和内质网对Ca2＋的调节有关。

钙网蛋白是一种应激性的钙结合蛋白，主要存在于内质网膜的网状结构中。内质网中的Ca2＋大都与钙网蛋白结合在一起，是细胞内钙流的缓冲剂。细胞内钙稳态发生变化时，可以刺激CRT表达上调并与Ca2＋结合来维持细胞内钙稳态的建立［8］，以维持内质网功能，从而保护细胞［9］。另外CRT还可以充当分子伴侣，对蛋白质进行加工维持蛋白质功能以及在减轻细胞凋亡过程中发挥重要作用。本实验结果显示，大鼠在热处理结束后，H1、H2、H3组骨骼肌中CRT较安静时显著增加，预示骨骼肌在热刺激下产生了保护性的应激反应，有利于骨骼肌的保护。

钙网蛋白是动物机体细胞内Ca2＋缓冲剂，肌质网对钙的调节主要通过钙网蛋白来实现，其调节过程与内质网膜上Ca2＋-ATP酶活性密切相关。有研究发现，缺血损伤的肌肉组织在钙超载后，会出现钙网蛋白表达上调，并据此减轻细胞内钙超载，来减轻骨骼肌缺血损伤。作为重要的应激蛋白，钙网蛋白与高温环境下钙流变化产生的适应性变化之间的研究并不多，且仅有的一些研究也大都集中在短暂热环境对心肌内质网、线粒体 Ca2＋及 Ca2＋-ATP酶影响方面。有研究表明，培养的心肌细胞在39℃～43℃温度下Ca2＋显著增加，同时大鼠心肌细胞内质网、线粒体钙含量在热应激后随温度升高显著下降，同时心肌细胞内质网和线粒体Ca2＋-ATP酶活力亦明显降低，心肌能量代谢发生障碍，心肌钙稳态严重失调，并且Ca2＋-ATP酶活力的下降可使细胞膜的流动性降低，以致膜结合蛋白的构象及生物功能受到影响［10］。Ca2＋升高可激活蛋白酶、磷脂酶、氧化酶系、PKC、ATP酶等Ca2＋依赖性酶，加重生物膜损害和诱发能量耗尽，导致Ca2＋超载的恶性循环，促使自由基产生，一定程度时产生损害细胞效应。而本实验结果表明，在经过半个月期间的温度递增的热处理后，大鼠骨骼肌肌质网及线粒体Ca2＋-ATP酶活性值并没有下降，反而升高，同时骨骼肌肌质网中的钙浓度增加，而线粒体的钙并没发生明显变化，显示肌细胞代谢功能未发生异常。热处理后，骨骼肌中的应激蛋白CRT在热处理后48小时内维持在一个较高的水平，与肌质网中钙浓度的变化趋势基本一致。本实验中，可能是首先的热刺激诱发了肌细胞产生了钙平衡的破坏，使得细胞内出现了钙紊乱，从而诱导细胞产生应激性的钙网蛋白，来纠正这种状态，并且在连续的递增的热处理过程中，这种纠正现象得到加强，进而诱导骨骼肌细胞产生了大量保护性的钙网蛋白，对Ca2＋稳态紊乱的进行调节，预示CRT对热处理过程中骨骼肌细胞中钙平衡的稳定起到了积极的作用，因此并未发生类似心肌钙平衡失调的现象。

研究表明，两个星期的热处理可明显提高机体在细胞、器官水平以及整体水平上的对氧化应激、长时间缺血以及耐热能力等应激的耐受能力，并且这种保护能力可以维持一定时间。另外实验证明，生物体热应激后其体内热应激蛋白合成增加，并且应激蛋白的保护能力随着应激后恢复时间的推移而增强，当恢复到一定时间时，动物可以获得最强的保护能力，此时组织的应激蛋白将达到高峰或是处于很高水平，而在此时间之后，保护能力又会跟着下降。本实验热处理增强了大鼠骨骼肌的内质网及线粒体Ca2＋-ATP酶的活性，提高了骨骼肌对钙平衡失调的调节，其原因可能是本实验方案采取了逐渐升高的热干预方式，并且持续时间较长，不同于单纯一次短暂热刺激，并最终增加骨骼肌细胞抵抗损伤的耐受力，提高了细胞在高温应激状态下的适应性。

热处理后，大鼠骨骼肌应激蛋白钙网蛋白显著增加，参与了大鼠骨骼肌内质网及线粒体Ca2＋浓度变化过程，同时热处理提高了骨骼肌细胞肌内质网及线粒体Ca2＋-ATP活性，这些过程有利于提高骨骼肌Ca2＋平衡调节能力，增强骨骼肌的适应性，对预防运动性的骨骼肌损伤有很好的借鉴意义。

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