酶法转化人参皂苷的研究

刘 莉,齐 滨,胡 娜,李慧敏,康忠宇

(长春中医药大学,长春130117)

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,在我国的应用已有数千年历史。现代药理学研究[1-2]表明,人参皂苷是人参的主要活性成分。随着对人参属植物化学成分研究的不断深入,人们已从人参全草及其加工品中共分离鉴定了50余种人参皂苷。目前认为人参的主要活性成分有人参皂苷Rg3、compound K 、Rh2、Rh3等 。它们都属稀有人参皂苷,在人工栽培的人参中基本不存在。最新药理学研究[3-5]表明,有些稀有人参皂苷对于细胞凋亡的保护、逆转白血病细胞耐药性、通过调节蛋白激酶C的活性及糖皮质激素样受体作用、抑制肿瘤细胞的增殖等都具有很好的功能。酶解法不仅可以有效改变人参皂苷的糖链结构从而实现人参皂苷的转化过程,提高稀有活性皂苷的产量,更具有一定的经济价值[6-9]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪(agilent technologies 1200)、冷冻离心机(centrifuge 5804R,eppendorf company)、立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-30SII型,上海博迅实业有限公司医疗设备厂),柱层层析硅胶100-200目及300-400目(青岛海洋化工厂),硅胶板(规格：100×100mm 厚度：0.20～0.25 mm,青岛海洋化工厂)。

1.1.2 试剂 Na2HPO4(北京化工厂)、柠檬酸(北京化工厂)、乙腈、甲醇均为色谱级,其他试剂为分析纯。人参根总皂苷提取物(宏久公司,50%HLPC)、人参二醇组皂苷(本实验室柱层析方法制备得)、湿热酶(本实验室提供)、标准品 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2、C-K(吉林大学化学学院)。

1.2 方法

1.2.1 人参二醇组皂苷的制备 1)人参根总皂苷样品分离制备二醇组皂苷：取1个玻璃柱,柱外壁每2 cm为1段,共6段,将拌有10 g人参根总皂苷的硅胶装入到柱内,洗脱剂洗脱,静置2h后将各段挖出用甲醇洗脱,收集各洗脱液,蒸干,研碎称重,计算收率。2)薄层层析法(TLC)检测各段皂苷 ：将皂苷标准品点样于薄层层析板上。在氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)的展开剂中展开,喷10%H2SO4甲醇溶液,吹干显色。

1.2.2 酶反应条件 由本实验室预实验确定酶反应条件为：培养基浓度：5.5 mg/mL,pH=5.0,反应温度：30℃。

1.2.3 人参二醇组皂苷酶解反应 1)溶液的制备：①缓冲溶液的制备,30 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液,pH=5.0;②酶试剂的制备,精密称量酶样0.250 g于50 mL锥形瓶中,量取制备的30 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液50 mL配置5 mg/mL的酶试剂溶液,溶解,过滤,即得;③人参二醇组皂苷试剂的制备,精密称定人参二醇组皂苷0.250 g于50 mL锥形瓶中,用超纯水50 mL配置5 mg/mL人参二醇组皂苷溶液,溶解,过滤,即得。2)人参二醇组皂苷酶解产物的制备：量取5 mg/mL的人参二醇组皂苷试剂50 mL为底物,置于100 mL已灭菌锥形瓶中,再量取5 mg/mL、pH=5.0的酶试剂50 mL与二醇组皂苷底物充分混合,封口,于30℃振荡培养箱中振荡培养。分别取0、2、4、6、8试样各20 mL 进行实验,各试样做2组平行实验。

1.2.4 酶解反应产物的分离纯化 各试样加入等体积正丁醇试剂进行萃取,混匀,离心,静置,取上清液-正丁醇层于60℃电热恒温水浴锅中挥干,得酶解产物。1.2.5 薄层层析法(TLC)检测酶解反应产物 用人参皂苷标准品及酶解反应产物点样。在展开剂为氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)的展开剂中展开,喷 10%H2SO4甲醇溶液后,吹干显色。

1.2.6 高效液相色谱法检测酶解反应产物 1)色谱条件：色谱柱ZORBAX SB-C18 173.4Bar(3 mm×50mm,1.8 μ m);流动相 ：乙腈(B)-水(A);流速为1 mL/min;柱温：30℃;波长：203 nm;梯度洗脱。2)标准品溶液的制备：精密称取标准品Rb1、Rb2和Rc各1mg于1号容量瓶中,Rd和Rg3各1 mg于2号容量瓶中,Rh2和C-K各1 mg于3号容量瓶中,加色谱甲醇定容。分别取上述3个容量瓶中人参皂苷混合溶液各200 μ L,混合均匀制备成混合标准品溶液,即标准品溶液。3)供试品溶液的制备：分别精密称取2.2.4挥干的酶解产物各1 mg于1mL容量瓶中,定容,制成每1 mL含1 mg供试品溶液,即得供试品溶液。4)标准品线性关系考察：各标准品溶液以 0.5、1、2、4 、5、8、10 μ L 为进样量,注入高效液相色谱仪,测定峰面积。5)高效液相色谱图谱：标准品溶液和各供试品溶液分别注入5 μ L于HPLC色谱仪中,测定保留时间和峰面积。

2 实验结果

2.1 分离人参二醇皂苷 TLC法得知人参根总皂苷提取物主要含有人参二醇组皂苷Rb1、Rb2、Rc等和人参三醇型皂苷Re、Rg3等皂苷。

酶解法得到Rg3、C-K等稀有皂苷必须从人参总皂苷分离出的人参二醇组皂苷才可以进行酶解。TLC检测结果显示人参二醇组皂苷主要富集于样品层和一段中。本次实验从人参根总皂苷10 g分离得到人参二醇组皂苷6.02 g,收率为60.2%,此分离方法得到较纯净二醇组皂苷且收率较高,故用此分离方法制备酶降解反应所用底物——人参二醇组皂苷。

2.2 酶法转化稀有人参皂苷

2.2.1 TLC检测酶解产物结果分析 按上述方法得到酶解产物,TLC结果显示人参二醇组皂苷Rb1、Rb2、Rc的斑点颜色随着酶解时间增加逐渐变浅,酶解8 d样斑点几乎没有;Rg3斑点颜色随着酶解时间增加逐渐变深,酶解6 d和8 d样斑点颜色明显加深并出现原底物没有的人参皂苷C-K。此检测结果证明酶解反应在不断降解人参二醇组皂苷转化产生稀有皂苷Rg3和C-K。

2.2.2 HPLC检测酶解产物结果分析 HPLC结果可见酶解反应底物——人参二醇组皂苷质量浓度明显减少,同时生成原始底物中没有的Rg3、C-K。Rb1、Rb2、Rc等二醇组皂苷在酶解反应第2天之后质量浓度急剧减少,而Rg3质量浓度增加,在第6天后增加幅度增大,可推测此酶转化产生Rg3活性较大。

3 讨论

人参皂苷是人参中主要的有效成分,人参皂苷抗肿瘤转移以及抗癌作用主要是基于人参皂苷肠内微生物的代谢产物。研究表明,具有良好抗肿瘤活性的Rg3和CompoundK就是人参皂苷代谢产物。而且经过酶转化后的人参皂苷消除了个体差异的影响,提高了生物利用度,减少了服用剂量。本实验室选用的此种湿热酶降解人参皂苷,结果发现其具有较强的转化人参皂苷的能力。通过HPLC检测到的各人参皂苷峰面积变化可知：随着培养时间的不同人参二醇组皂苷逐渐减少,转化为稀有人参皂苷Rg3和C-K。此实验证明：此种湿热酶能够转化人参二醇型皂苷为稀有皂苷Rg3以及C-K。其转化机理还有待进一步研究。

本实验室筛选出的此种生物活性酶为转化人参皂苷寻找合适的工业生产条件,对大规模工业化生产稀有人参皂苷奠定基础,具有重要的意义。

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