采用生色底物测定尿激酶效价的方法探讨

谢京

摘 要：文章提供了一种采用生色底物测定尿激酶效价的方法，即使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐作为底物来进行分析。采用此生色底物法测得结果与气泡法测定结果基本上是一致的。经实验证明，生色底物法更易于操作，简捷快速，准确度及重现性也较好。

关键词：尿激酶 效价测定 底物

中图分类号：Q556.9 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2017）04（c）-0167-02

尿激酶由人體肾脏生成，是可以通过人体新鲜的尿液进行分离提纯进而得到的一种碱性蛋白水解酶。而要测定尿激酶的效价方法有很多，如平板法、小球下落法、合成底物法以及《中华人民共和国药典》记载的气泡上升法等。此文采用生色底物法测定尿激酶效价，使用L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐作为底物，是依靠尿激酶的酶活性来水解底物产生对硝基苯胺，并选择在405 nm波长处测定吸光度。

1 材料

1.1 仪器与试药

日本岛津UV-2550紫外分光光度计。

尿激酶标准品购自中国药品生物制品检定所；尿激酶供试品购自北京唯美生物技术公司；L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐购自积水化学工业株式会社；明胶为生物试剂；三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、冰醋酸、均为分析纯。

1.2 溶液制备

醋酸溶液配制需取20 mL冰醋酸用纯化水稀释成50 mL；

需用纯化水稀释L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐配制成浓度为0.6 mmol/L的底物溶液。

缓冲液的配制需将三羟甲基氨基甲烷6.06 g和氯化纳2.22 g放在一起，大约加700 mL纯化水进行溶解；再单独取10 g明胶加适量的纯化水进行加热溶解。将此溶液搁置直到凉了以后，再将这两种溶液混合在一起摇匀，取稀盐酸将溶液的pH值调至8.8，再往里加入纯化水稀释至1 000 mL。

2 确定测定条件的方法

2.1 反应时间的确定

当水浴温度为37 ℃时，取60 IU/ml的供试品溶液与底物溶液混合在一起进行反应5～40 min。经过抽取不同时间的检测结果发现，在30 min以内的酶反应速度呈现出有规律的递增趋势，而在30 min过后的酶反应速度的递增趋势却没有之前那么明显，有所减弱。故测定过程中酶反应的时间确定为30 min。

2.2 检测波长的确定

要确定检测波长，需取底物溶液分别与30 IU/mL、120 IU/mL 2种不同浓度的供试品溶液混合在一起发生反应，最后分别往里加入醋酸溶液摇匀，反应停止，选择在波长范围250～480 nm内进行测定其吸收光谱。与此同时尿激酶水溶液、底物溶液以及缓冲液的吸收光谱也需要一一进行测定。通过反复实验，在波长为405 nm处时缓冲液有少量吸收，而尿激酶水溶液和底物溶液都没有吸收，但是发生化学反应后所生成的产物却对硝基苯氨有吸收。所以试验过程中选用测定吸光度的检测波长定为405 nm。

2.3 底物浓度的确定

37 ℃水浴中，采用配制好的pH8.8的缓冲液稀释尿激酶标准品成30 IU/mL的溶液，测定得到米氏常数Km=5.5×10-5mol/L。用纯化水配制不同浓度的底物溶液。从理论知识上我们知道了当底物浓度达到最大值的合理浓度时酶反应会激发它最大的活性，底物浓度为10 Km时反应速度在理论上计算出的约91%的极限值。检测酶活性时底物浓度有轻微改变，但几乎不影响反应的速度，如有物质会抑制酶进行反应，在底物用量为10 Km时几乎不影响反应的速度，则说明在一定时间段内反应的速度恒定不变。所以底物浓度标准设定为0.6 mmol/L。

2.4 缓冲液pH值的确定

缓冲液配制过程中，将两种溶液混合均匀后，用稀盐酸分别调制成若干pH值不同的溶液，然后再分别与尿激酶供试品混合配制成30 IU/mL的溶液，再与配制好的底物溶液混合发生反应。随后采用分光光度法在波长405 nm处测定其吸光度。反复试验后得出缓冲液的pH值于8.5～9.0时测出的酶活性最高。因此缓冲液的最佳pH采用8.8。

2.5 水浴温度的确定

众所周知，水浴温度对某些物质之间进行的化学反应是有一定影响的，而对尿激酶效价的检测方法却也是对水浴温度有一定要求。用30 IU/mL供试品溶液与底物溶液混合，让其分别在不同温度的水浴中进行化学反应，结果却发现，不同温度下测得的结果却是有区别的。经过反复试验测出37 ℃是个临界点，低于37 ℃测到的酶活性会随着水浴温度的升高呈上升趋势。当水浴温度位于37 ℃～45 ℃之间时，所测到的酶活性是最高的。而超过45 ℃之后呈下降趋势，这说明过高温度会破坏酶的活性。所以37 ℃可以作为检测尿激酶效价测定实验时的水浴温度选择。

3 测定方法及回收率试验

3.1 制备标准曲线

采用缓冲液将尿激酶标准品正确调配为50 IU/mL的尿激酶标准溶液。取干净小试管6支并往每支试管内都加入2.0 mL的底物溶液，置于37 ℃水浴中。接着将不同量的尿激酶标准液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别加入到6支试管内，再根据每个试管的溶液量多少分别加入缓冲液至1.0 mL。经过30 min准确无误的反应过后，再分别往小试管里加入1.0 mL醋酸溶液摇匀，反应停止。放至室温，在选定波长405 nm处测定其吸光度。最后计算标准曲线方程，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出：Y=0.0304+0.05355X，r=0.9984，n=3。反复试验检测结果显示，在浓度范围10～50 IU/mL内尿激酶与吸收度持线性关系。

3.2 稳定性试验

待制备好标准曲线后将其溶液放于室温，分别在不同的时间一一测定其吸光度，最后结果显示24 h内吸光度并没有明显变化。

3.3 回收率试验

通过在相同的条件下进行的6次试验记录下的结果可以利用回归方程计算出浓度，所得平均回收率为101.4%，相对标准偏差为0.86%。试验过程如下：取2.0 mL的底物溶液于干净小试管内后并将其置于37 ℃的水浴中。同时取10 mL 30 IU/mL的尿激酶供试品溶液与10 mL 30 IU/mL的尿激酶标准溶液混合在一起摇匀。接着往小试管内加入上述两者混合的尿激酶溶液1.0 mL。经过30 min准确无误的反应过后往小试管内加入1.0 mL醋酸溶液摇匀，反应停止。放至室温，并在选定的波长405 nm处测定其吸光度。

4 尿激酶供试品的效价测定

采用回收率试验中所使用的测定方法，取尿激酶供试品用缓冲液稀释至30 IU/mL的溶液进行测定，6次结果记录好，以便与用气泡上升法测试出来的结果进行对照。配制试剂溶液和测定供试品效价的方法均按《药典》2010年版二部尿激酶效价测定法进行，采用此公式计算结果，尿激酶效价=（供试品单位数每毫升单位数×稀释倍数）/取样量。采用两种方法进行测定后所得结果对照如表1。然而在实际操作过程中如若不小心让微生物污染了底物溶液，则会引起底物水解从而使得实际的底物浓度要偏低， 最后会对测定结果产生影响。将调制好并已放了3 d的底物溶液与刚配好的新鲜底物溶液在完全相同的反应条件下分别进行反应。通过检测显示搁置了3 d的底物溶液反应后在波长405 nm处被测到的吸光度与新鲜溶液比较已经有所下降了。因此在配制溶液时所需的容器、溶剂都需要通过无菌消毒处理，如此便可以更好地延长底物溶液的贮存时间。

从表1的结果可以看出，生色底物法测定的尿激酶效价的结果与药典记载的气泡上升法测定出来的结果基本上是一致的。

5 结论

综上所述，文章归纳了酶反应最适合的基础条件是：37 ℃水浴温度，采用pH8.8的三羟甲基氨基甲烷-明胶缓冲液配制的尿激酶溶液与底物溶液浓度为0.6 mmol/L发生反应30 min。最后再往里加入醋酸溶液摇匀，反应终止，通过分光光度计在波长405 nm处测定其吸光度。记录后的结果表明尿激酶浓度在10～50 IU/mL范围内与吸光度之间呈线性关系。

药典记载的气泡上升法也可以测定尿激酶效价，但与生色底物法相比，气泡上升法在测定过程中存在着较多的问题。因为气泡上升法在测定尿激酶效价时使用的试剂会相对偏多，而且都是一些蛋白质或者酶类物质，这些物质都很容易发生质变。最后还是通过肉眼来决定反应的终点，如此就易产生由人为因素而引起的误差。而文章讲述的生色底物法却是利用尿激酶与所选底物L-焦谷氨酞甘氨酞-L-精氨酸-對硝基苯胺盐酸盐进行反应从而产生淡黄色针状结晶物对硝基苯胺，再通过紫外可见分光光度计进行分光光度法测定其吸光度。与气泡上升法相比较，生色底物法更易于操作，简捷快速，准确度及重现性也较好。

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