产气荚膜梭菌α毒素分子生物学研究进展

张艳平，唐成程，许崇波

1.大连大学 a.生命科学与技术学院；b.医学院；辽宁 大连 116622；2.吉林大学 畜牧兽医学院，吉林 长春 130062

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一，该菌的致病因子是其所产生的外毒素。迄今，已发现的产气荚膜梭菌外毒素有12种（α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν）之多，但起主要致病作用的只有4种（α、β、ε和ι），据此将该菌分为A、B、C、D、E等5个毒素型。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素（C.perfringens alpha-tox⁃in，CPA），它是产气荚膜梭菌最重要的致病毒素之一[1-2]，国内外学者对产气荚膜梭菌α毒素进行了大量的研究，并取得了一些研究成果。在此，我们对产气荚膜梭菌α毒素的生物学特性、基因克隆与转录调控、基因表达与基因融合、基因定点突变与结构分析、N端和C端的结构与功能等方面的研究进展进行简要综述。

1 生物学特性

α毒素是一种多功能性金属酶，具有磷脂酶C（PLC）和鞘磷脂酶（SMase）等2种酶活性，能同时水解磷脂酰胆碱和鞘磷脂。α毒素依靠这2种酶活性，水解组成细胞膜的主要成分膜磷脂，破坏细胞膜结构的完整性，导致细胞裂解，从而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。α毒素的溶血活性具有冷热溶血效应（hot-cold hemolysis），即α毒素在37℃与红细胞作用时，红细胞并不发生裂解，只有当红细胞变冷至4℃时才会发生裂解。已在小鼠、家兔、绵羊等红细胞上发现了α毒素的这种冷热溶血效应[3]。α毒素可被EDTA、邻二氮杂菲可逆性抑制，还可被乙醚偶联的磷脂酰胆碱抑制。去污剂可增加α毒素活性，这是由于磷脂或甘油二酯的可溶性，而不是由于去污剂对蛋白质的作用。α毒素对胰酶敏感，2.5%的胰酶与α毒素于37℃作用1 h，即可使其完全失活[4]。此外，Titball等报道[5]，当把α毒素加热至60～70℃时就可以使其失去活性，而当进一步加热到100℃时，又可以恢复部分生物学活性。

2 基因克隆与转录调控

α毒素基因位于染色体上，其结构基因大小为1194 bp，编码的产物由398个氨基酸残基组成，相对分子质量约为45.5×103。其中信号肽为28个氨基酸残基，其余370个残基构成的成熟肽的相对分子质量约为43×103。α毒素编码区G+C含量为34%，SD序列为CGGGGG，-10区序列为TATAAT，-35区序列为GTGAGG，终止密码子为2个连在一起的TAA。Katayama等[6]比较了A型和C型产气荚膜梭菌α毒素的基因序列，证实二者有18个碱基不同，结果导致6个氨基酸残基不同，其他部分相同。虽然A型菌α毒素成熟肽与C型菌α毒素成熟肽有6个氨基酸残基的不同，但却具有相同的磷脂酶C活性和溶血活性。Effat等[7]比较了5株A型菌株、1株B型菌株、1株C型菌株、2株D型菌株和1株E型菌株的α毒素的核苷酸序列及编码的氨基酸序列，在1194 bp编码区里，不同菌株之间平均有1.3%的核苷酸序列不同，有1.2%的氨基酸序列不同，但并不影响α毒素本身的活性，各型菌株产生的α毒素具有相同的生物学功能。

Sakurai等[8]报道，5种毒素型产气荚膜梭菌的α毒素的产量是不同的，甚至同一种毒素型产气荚膜梭菌在不同生长时期的α毒素的产量亦不同[8]。Toy⁃onaga等[9]研究证实α毒素的产量是在转录水平上调控的，他们将启动子-35区上游富含A+T序列缺失0.7 kb，结果α毒素的表达量增加10倍，表明该区在基因表达时呈负调控作用。核苷酸序列分析证明，在α毒素基因上游-66～-40间存在3个周期性重复的（dA）5-6序列，当缺失含2个（dA）5-6区的77 bp片段时，α毒素表达量异常增加。这些实验结果充分说明了α毒素启动子上游的基因序列对α毒素基因的转录呈负调控作用，这种调控作用可能是由于该区DNA扭曲的潜在影响。Katayama等[6]报道，在相同培养条件下，A型菌株比C型菌株的mRNA含量高23倍。另外还证实，A型产气荚膜梭菌菌株中含有特异的DNA结合蛋白，如果将α毒素基因分成3个片段A、B和C，A型和C型菌株都含有特异结合片段A的特异DNA结合蛋白，只有A型菌株含有特异结合片段B的特异DNA结合蛋白，这种特异DNA结合蛋白可能是A型菌株α毒素产量高于C型菌株的一个因素。Tsutsui等[10]报道，α毒素高产毒菌株A型产气荚膜梭菌NCTC8237和PB6K的mRNA含量比低产毒菌株B、C、D型的mRNA含量高40倍左右。从上述这些实验结果可以推测，α毒素的产量可能是像多数原核生物一样是在转录水平上调控的。

3 基因表达与基因融合

α毒素的启动子是最强的启动子之一，可被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因而α毒素在自身启动子下不仅可在产气荚膜梭菌本身中高效表达，也可在大肠杆菌中得到高效表达。此外，也可将其置于其他启动子下，转化大肠杆菌后获得高效表达。许崇波等[11]利用PCR技术，从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因，构建了含α毒素基因的重组大肠杆菌BL21（DE3）（pXETA02）。经酶切鉴定和测序证实，构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western印迹分析和ELISA检测，重组菌株表达的α毒素能够被α毒素单抗识别。以IPTG为诱导剂，优化表达条件后，α毒素的表达量占菌体总蛋白的34.83%。以乳糖为诱导剂，优化表达条件后，α毒素的表达量占菌体总蛋白的23.82%。动物实验结果表明，用重组α毒素免疫的小鼠可以抵抗1 MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。

许崇波等[12-14]进行了α-β2-β1抗原基因融合、表达及其免疫原性研究。首先，从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1.2 kb的α毒素基因、0.95 kb的β1毒素基因、0.72 kb的β2毒素基因，酶切回收的3种毒素基因片段分别插入表达载体pET-28c，构建了3种重组质粒pETXA1、pETXB1、pETXB2，构建了α-β1毒素融合基因重组质粒 pETXAB1、β1-β2毒素融合基因重组质粒pETXB1-2和α-β2-β1融合基因重组质粒pXETAB2B1。以IPTG为诱导剂诱导重组菌株表达的优化条件是:培养基pH7.5，培养温度37℃，IPTG浓度0.4 mmol/L，菌体生长密度D600nm达到1.0时加入IPTG，诱导5 h，此时α-β2-β1融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22%。α-β2-β1融合基因表达产物的Western印迹结果表明，在相对分子质量约95×103处出现C型产气荚膜梭菌抗血清的识别条带，表明α-β2-β1融合蛋白可以被特异性抗体识别。生物学功能测定和动物安全性试验证实重组菌株无致病性，十分安全。免疫原性研究表明，α-β2-β1融合蛋白具有良好的免疫原性和中和α、β1、β2毒素活性的能力，为今后从事产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗奠定了良好的工作基础。

4 基因定点突变与结构分析

α毒素的氨基酸组成对其生物学功能有着重要的影响，其中个别氨基酸对其生物活性起着十分重要的作用[15]。Guillouard等[16-17]将56位的天门冬氨酸突变成丝氨酸、天门冬酰氨、谷氨酸或谷氨酰氨之后，突变的毒素完全丧失了α毒素的溶血活性、磷脂酶C活性和鞘磷脂酶活性。当130位的天门冬酰氨发生突变后，突变毒素活性只有天然毒素的约1/100，同时还证实，56位的天门冬酰氨对α毒素的酶催化作用是必需的，而130位天门冬酰氨对其结构的维持是必需的。尽管上述不同位点的氨基酸发生突变之后，对α毒素的生物学活性有着不同程度的影响，甚至可使其生物活性完全丧失，但仍然保持着天然毒素的部分或全部抗原性。

Nagahama等[18]利用定点突变技术，研究了组氨酸残基在α毒素中的作用。他们将第68位组氨酸残基突变成甘氨酸残基，结果突变的α毒素完全丧失了α毒素本身的磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性。如果将第126位、136位组氨酸残基突变成甘氨酸残基，突变的α毒素活性只有天然α毒素活性的1/100。如果将第46、207、212、241位组氨酸残基突变成甘氨酸残基，结果突变的α毒素活性和天然α毒素活性相比没有什么变化，这表明上述4个位置的组氨酸残基对α毒素具有生物活性不是必需的。Nagaham等[19]证实，74位的酪氨酸也是一个对α毒素的生物学活性起着重要作用的关键氨基酸残基，当其被突变置换后，可使其生物学活性降低至1/250。作者还研究了N端酶活位点附近57位和65位酪氨酸的作用，将以上位点用丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸突变后，没有影响鞘磷脂酶的活性，然而丙氨酸和亮氨酸突变体在羊红细胞中的溶血性和对脂质体的结合都显著降低。将2个突变体毒素结合到脂质体上，并用环境敏感荧光基团标记后追踪，发现其存在于双分子层疏水区。以上实验证实57位和65位酪氨酸残基对α毒素渗透进双分子膜和鞘磷脂催化位点过程起着重要作用，但不参与酶活反应。Na⁃gahama等[20]将152位的谷氨酸突变成甘氨酸或谷氨酰氨后，其生物学活性完全丧失，但当用天门冬酰氨置换后则不能完全丧失这些活性。上述位点氨基酸的突变并不影响α毒素与绵羊红细胞的结合及从溶液中吸收游离锌离子的特性。Alape-Giro等[21]将α毒素结合钙离子的269位和336位天冬氨酸残基突变为天冬酰胺后，其溶血活性下降了20%，细胞毒性降低至1/1000。实验结果还证实体内鞘磷脂酶活性和C端区域对于体内肌肉毒性是非常重要的，上述突变体毒素肌肉毒性相比野生型减少了12%。因此，该实验解释了所研究的氨基酸残基对于产气荚膜梭菌磷脂酶C毒性的重要性。

许崇波等[22]对A型产气荚膜梭菌α毒素第68位组氨酸突变体及其结构进行了研究。他们将A型产气荚膜梭菌α毒素（CPA）第68位组氨酸（CAT）定点突变成甘氨酸（GGT），构建了含CPA突变基因表达质粒的重组大肠杆菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G），其表达量占菌体总蛋白的31.65%。应用EXPASY服务器（http://www.expasy.org/tools）的 SOPMA 法对CPA和CPA-His68Gly突变体分子进行2级结构预测，结果显示CPA蛋白含有118个α螺旋、78个β折叠、44个β转角、130个无规则卷曲，CPA-His68Gly突变体含有118个α螺旋、79个β折叠、45个β转角、128个无规则卷曲。从预测的CPA及CPA-His68Gly突变体分子的2级结构来看，二者除第68突变位点由无规则卷曲变成β转角和第69位由无规则卷曲变成β折叠外，其余的2级结构没有发生变化，说明CPA和CPA-His68Gly突变体分子的2级结构基本一致。以蛋白质结构数据库（PDB）中已解析的CPA三维结晶结构（3D）为模板，在线（http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html）利用同源模型构建CPA和CPA-His68Gly突变体分子的3D结构，应用Rasmol分析软件绘制其3D结构图，结果显示CPA共有10段α螺旋，8段β折叠，而CPA-His68Gly突变体的3级结构与CPA的3级结构相似。同时，将重组大肠杆菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G）的培养上清、菌体及菌体裂解物涂布于卵黄琼脂平板上，均不出现特征性浑浊环，表明它们不能分解卵黄琼脂平板中的卵磷脂，这说明重组菌株已不具备CPA的磷脂酶C活性，而A型产气荚膜梭菌标准株C57-1培养上清在卵黄琼脂平板上出现了特征性浑浊环。同时经腹腔注射或口服途径接种重组大肠杆菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G），结果3周后小鼠全部存活，无异常表现，经剖检观察无病理变化，表明该菌株丧失了CPA活性，已无致病性，而A型产气荚膜梭菌标准株C57-1对照组则出现典型的临床症状和病理变化。免疫实验结果表明，重组大肠杆菌BL21（DE3）（pMCPA-H68G）灭活菌体免疫组保护率为94%（75/80），A型产气荚膜梭菌标准株C57-1类毒素免疫组保护率为95%（76/80），而生理盐水对照组20只小鼠全部死亡，这说明构建的A型产气荚膜梭菌CPA-His68Gly突变体蛋白和A型产气荚膜梭菌标准株C57-1类毒素的免疫保护效果基本相同。

5 N端和C端的结构与功能

Titball等[23]对α毒素是否由2个区域组成进行了研究，他们构建了一个截短的α毒素CPA1-249，其表达产物保留了磷脂酶C活性，能水解磷脂酰胆碱，但却失去了α毒素的鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性，这表明α毒素N端可能具有溶血活性和致死性。随后，Titball等[5]又构建了α毒素C端CPA247-370，结果它不具有鞘磷脂酶活性、溶血性和致死性。然而，当用CPA1-249和CPA247-370共同作用于小鼠红细胞时，却能使小鼠红细胞发生溶血，这表明C端能将溶血活性赋予N端，但也不能否认，CPA247-370结合CPA1-249后相互作用时，CPA 247-370构象发生变化，从而激活CPA247-370的活性位点，使其具有了酶活性。同时还证实α毒素的C端和真核细胞的一种脂质代谢酶——花生四烯酸脂肪氧化酶N端之间有同源性，均含有5个连在一起的酪氨酸残基，疏水性酪氨酸残基与糖类底物识别一致。通过化学修饰研究，还证实α毒素中组氨酸残基和锌离子的协同作用是很重要的，锌离子结合在组氨酸残基上[24]。

Nagahama等[25]构建了α毒素N端CPA1-250和C端CPA251-370，并研究了它们在α毒素生物学活性中的作用。产气荚膜梭菌α毒素N端CPA1-250和蜡样芽胞杆菌磷脂酶C（BcPLC）一样都具有磷脂酶C活性，但前者不能结合兔红细胞，也不能裂解兔红细胞。由BcPLC和C端CPA251-370构建的杂合蛋白BC-CPA251-370能结合在红细胞上且能裂解红细胞。N端CPA1-250和C端CPA251-370在一起孵育后能够实现完全互补且具有溶血活性和磷脂酶C活性，C端CPA251-370也能赋予BcPLC溶血活性。C端CPA251-370能够显著激活N端CPA1-250的磷脂酶C活性。进一步研究表明，C端CPA251-370对N端CPA1-250的相互作用显示，可以诱导N端CPA1-250的结构改变，但是不能赋予N端CPA1-250溶血活性。动力学分析表明，C端CPA251-370能提高对底物N端CPA1-250的的亲和力。作者使用荧光标记C端CPA251-370实验首次证实，C端CPA251-370可以插入细胞膜脂质双层，能够引起N端CPA1-250接近磷脂酰胆碱，导致N端CPA1-250水解膜内的磷脂酰胆碱和破坏细胞膜。上述实验结果表明，C端CPA251-370在结合红细胞以及N端CPA1-250的溶血活性和酶活性方面发挥非常重要的作用。

Williamson等[26]克隆表达了CPA1-249和CPA 247-370，这2种产物的生物学效应有所不同。CPA1-249免疫动物后产生的抗体能中和α毒素的磷脂酶C活性，但不能中和α毒素的溶血活性。CPA247-370免疫动物后产生的抗体既能中和α毒素的磷脂酶C活性，也能中和α毒素的溶血活性，而且CPA247-370免疫鼠可抵抗至少10 LD100剂量的A型产气荚膜梭菌攻毒。这些试验结果充分说明，α毒素确实由2个区域组成，N端具有磷酯酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，只有两者协同作用，才具有溶血活性和致死活性。单独α毒素N端CPA1-249和C端CPA247-370的毒性很低，但其免疫动物后产生的抗血清中和效果不同，这是由于CPA247-370在单独表达后，形成的高级结构与α毒素完整结构相似，故能中和α毒素的溶血活性和致死活性，表明α毒素的保护性抗原为其C端。如果是后者，C端在调控酶活性方面将起着重要作用[27-28]。总之，α毒素可能由2个功能区组成，N端具有磷脂酶C活性，C端具有鞘磷脂酶活性，然而仅依靠磷脂酶C活性不足以使α毒素具有毒性。α毒素C端表现溶血特性，如果去除α毒素的C端，就会大大降低鞘磷脂酶活性，但检测不到α毒素的溶血性和致死性，可能是这些区域使蛋白质发生了构型改变，易于和细胞膜发生反应的缘故。

综上所述，近年来关于产气荚膜梭菌α毒素的研究报道，主要侧重于α毒素基因的定点基因突变、α毒素N端和C端生物学功能，以及α毒素与靶细胞作用方式等方面，而关于产气荚膜梭菌α毒素的基因转录调控、致病机制，以及α毒素在5种毒素型（A、B、C、D、E）产气荚膜梭菌中的致病作用还需要进行深入细致研究，这对于阐明产气荚膜梭菌α毒素的基因转录调控机制和致病机制具有重要的理论意义和实践价值。

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