甲烷单加氧酶的研究进展

徐宁 ，辛嘉英 ,，王艳 ，董静 ，夏春谷

1.哈尔滨商业大学 省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；

2.中国科学院兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000

加氧酶是一类能高效而专一地催化分子氧掺入各种有机化合物的酶，根据加氧方式的不同，可分为单加氧酶和双加氧酶[1]。甲烷单加氧酶（methane monooxygenase，MMO，EC.1.14.13.25，）是单加氧酶中非常重要的一种酶，可以将分子氧中的一个氧原子插入极稳定的甲烷分子的碳氢键中，另一个氧原子则还原成水[2]。因此，对于以甲烷为惟一碳源生长的甲烷氧化细菌而言，MMO在分子氧的作用下催化甲烷氧化成甲醇，而成为甲烷氧化细菌代谢过程中的重要酶系[3]。甲烷氧化细菌代谢途径中甲烷氧化的过程可参阅文献[4]。

由于上述反应，甲烷氧化细菌能生物性转化大气中日益增加的温室气体甲烷，从而有助于缓解温室效应[5]。此外，甲烷氧化细菌通过MMO氧化甲烷释放出的有机物可以作为污水脱氮过程中的电子供体，以解决城市污水处理问题[6]。除了催化甲烷进行单加氧反应外，MMO还可以将氧原子插入其他烃类的碳氢键中[7]，MMO催化烯烃生成的环氧化合物是化学合成制药工业的重要中间体，催化卤代烃类和芳香烃类在环境污染的控制中具有潜在应用价值，如甲烷氧化细菌中的MMO可以催化三氯乙烯生成三氯乙醛，进而被甲烷氧化细菌进一步氧化成酸性产物，达到降解三氯乙烯消除环境污染的目的[8]。

MMO优越的催化性质使其受到了极大的关注，关于其结构组成、催化机理、应用前景等方面的研究也成为目前的研究热点。

1 MMO的组成与结构

MMO是一类含有双核铁活性中心的非血红素蛋白酶，可从6种不同的能氧化甲烷的细菌（Methy⁃losinus trichosporium，Methylococcus capsulatus，Meth⁃ylosinus sporium，Methylocystis sp.MM1，Methylomo⁃nas methanica 68-1，Methylobacterium sp.CRL-26）中提取到无细胞的具有MMO活性的制剂[9]。已知MMO有2种类型：一种是分泌在周质空间中的可溶性MMO（soluble MMO，sMMO），存在于大部分甲烷氧化细菌中；另一种是与细胞膜结合的颗粒性MMO（particulate MMO，pMMO），存在于除Methylocella以外的已发现的所有甲烷氧化细菌中。2种类型MMO的结构都比较复杂，都含有多个亚基和辅助因子，但它们在催化底物特异性上存在差异：pMMO的底物范围相对较窄，只能氧化C1～C4的烃类和烯烃；相反地，sMMO催化的底物范围更广，包括C5～C9的烃类、烯烃、芳香族化合物和卤代烃等。

1.1 sMMO的结构

来源于Methylococcus capsulatus（Bath）和 Methy⁃losinus trichosporium OB3b的sMMO被广泛研究。sMMO是一种含铁的非血红素酶，由3个组分构成，分别是羟基化酶（MMOH）、蛋白调节酶（MMOB）和还原酶（MMOR）。MMOH是由3个亚基组成的二聚体α2β2γ2，3 个亚基的相对分子质量（Mr）分别为 60×103、45×103和 20×103。每个α亚基含有一个非血红素和一个羟基桥连接的双核铁中心，在这个中心甲烷和氧气相互作用形成甲醇，这是酶的活性中心，这种晶体结构已被证实[10]。MMOH的α亚基和β亚基间存在一条通道，该通道下面约12Å处是双核铁中心。MMOB的Mr为16×103，其活性可由其N端的水解进行调节，其作用是调节还原酶和羟化酶的电子传递过程。第3个组分MMOR的Mr是39×103，接受来自NADH2的电子，通过［2Fe-2S］和FAD辅因子，将其传递给MMOH的双核铁中心活性位点。

天然状态下，MMOH中的双核铁中心处于氧化态，即2个三价铁离子Fe（Ⅲ）Fe（Ⅲ），这2个Fe（Ⅲ）通过由一个羟基、一个谷氨酸和一个水分子的外源桥构成的三重桥彼此连接，此时氧化态的MMOH没有活性。在催化性循环中，这个双核铁中心首先被还原为混合态即Fe（Ⅲ）Fe（Ⅱ），开始表现MMO活性，当MMOH进一步被还原时，双核铁中心就被还原为还原态的2个二价铁离子Fe（Ⅱ）Fe（Ⅱ），二者是以μ-O连接的[11]，活性明显增加，电子通过还原酶从NADH转移到MMOH上。每个铁原子都有6个配位子，1个配位了来自组氨酸的氮原子，5个配位来自谷氨酸残基、羧基、羟基和水分子的氧原子，双核铁中心通过氢键将Thr213陷入这个酶活性腔内。氧化状态的双核铁中心可以改变它的外源性配位子的连接和形状，这个特性对催化性循环中的sMMO而言非常重要，在催化性循环状态下发生了羧化物转化，氢氧化物离子平移并且打开配位点与氧气发生反应，形成双铁过氧化物中间物[12]。氧化态和还原态MMOH的结构模型已被证实[13]。

1.2 pMMO的结构

目前，对sMMO的结构和催化机制的研究较多，特别是其结构中的氧桥连接的双核铁中心，而对pMMO结构模型的研究相对较少。

2005年，对从Methylococcus capsulatus（Bath）中分离到的pMMO的X线结构的研究，标志着pMMO结构研究上的一次突破[14]。pMMO是由3个亚基构成的三聚体结构，pmoA、pmoB和pmoC等3个亚基暴露于反式膜区域上部，组成了一个α环。之前的研究没有预测出这个三聚体结构，通过电子显微镜观测到了pMMO的形状和容积，证明了其与三聚体结构的生物学关联性[15]。

在上述pMMO的晶体结构中存在3个金属位点，一个金属位点是单核铜离子，位于膜上25.5Å处，该铜离子配位了2个组氨酸His48和His72，其中His48残基并不保守，这个位置多为天冬酰胺残基，而组氨酸则由谷氨酰胺替代，而His72存在于许多pmoB中，相应的位置是精氨酸，但这个结构并不是完全保守的。第二个金属位点是锌离子，存在于反式膜区域（锌这个位点可能是偶发的，因为结晶介质需要这种金属，在纯化的pMMO中不含有锌），该锌离子被pmoC上的Asp156、His160和His173以及pmoA上的Glu195配位，这4个残基坚固。还有一个金属位点是双核铜离子簇，2个铜离子的间距为2.6Å，其中一个铜离子连接了2个组氨酸（His137和His139）咪唑，另一个铜离子连接了一个咪唑以及pmoB亚基的N端[16]。

与上述从Methylococcus capsulatus（Bath）中分离的pMMO的晶体结构不同，从Methylosinus trichospo⁃rium OB3b中分离到的pMMO的晶体结构中缺少单核铜离子位点，而且锌离子也被铜离子取代[17]。双核中心通过与其他残基结合而被牢牢固定[18]。

2 MMO的催化机理

2.1 MMO的电子转移

甲烷氧化细菌通过sMMO催化NADH和O2配对将甲烷转化为甲醇：

NAD（P）H+H++CH4+O2→ NAD（P）++CH3OH+H2O

在sMMO的结构中，MMOH是活性中心，MMOB紧密地连接在α亚基的MMOH上，MMOR中的电子转移次序是NADH→FAD→FeS→受体，在这个途径中，被NADH还原的FAD（位于MMOR）把电子传递至FeS中心，这一中心再把电子直接传递给MMOH中的FeFe中心，但该过程中没有底物氧化作用发生，也没有MMOB的参与[9]。被还原的MMOH要与被氧化的底物结合，在MMOB的存在下即能实现氧化作用，MMOB起作用的部位尚不清楚，但其在甲烷氧化细菌氧化甲烷的过程中是必要的。

2.2 MMO的催化机理

MMOH是sMMO的活性中心，特别是其双核铁中心是MMO的催化活性单元。甲烷氧化细菌氧化甲烷的催化反应中，氧化状态的双核铁中心Fe（Ⅲ）Fe（Ⅲ）首先接受来自NADH的2个电子成为还原态Fe（Ⅱ）Fe（Ⅱ），然后还原态的双核铁中心与氧分子发生反应，经过2个中间体O和P，最终形成Fe（Ⅳ）双核铁簇Q，中间体Q与底物分子结合，进一步形成中间体R和T，释放出产物并重新回到MMOH的氧化状态。O、P、Q、R、T指的是催化循环过程中不连续的中间体，这些中间体在催化循环中扮演着很重要的角色[19]。

2.3 MMO的基因表达

2.3.1 sMMO的基因结构 目前研究较深入的是Methylococcus capsulatus（Bath）和 Methylosinus trichosporium OB3b的sMMO基因。mmoX、mmoY、mmoZ分别编码MMOH中的α、β、γ亚基，mmoB和mmoC编码MMOB，有趣的是，mmoB位于mmoY和mmoZ之间。ORF（指的是orfY）的功能尚未知，它的编码容量是 12×103，位于 mmoZ 和 mmoC 之间[20]。sMMO基因簇的3个主要转录子为：①mmoX；②mmoY，mmoB，mmoZ；③mmoY，mmoB，mmoZ，orfY，mmoC。

2.3.2 pMMO的基因结构 从Methylococcus capsu⁃latus（Bath）分离的pMMO，其基因簇按照pmoCAB排列，其中pmoB编码45×103的α亚基，pmoA编码26×103的β亚基，pmoC编码23×103的γ亚基[20]。

2.3.3 MMO的基因调控 Methylococcus capsulatus（Bath）和Methylosinus trichosporium OB3b既能产生sMMO又能产生pMMO，二者的表达受铜离子浓度的调控。当铜离子浓度低时sMMO表达，铜离子浓度高时pMMO表达而sMMO不表达。

该表达模式假设存在调节器抑制物R、活性剂和铜结合调节器CBR、pmo操纵子的σ70启动子。铜离子浓度高时，CBR和铜离子结合，构形发生变化，CBA还和R、A结合在一起，这样，阻止了R抑制pmo基因，阻止A激活smo基因，因此pMMO表达。铜离子浓度低时，CBR不能和R或A形成复合物，这样R就能抑制smo基因的转录，A就能够激活smo基因，促使连接在RNA聚合酶上的σ54开始转录[20]；亦或者是结合的铜离子可能直接改变R和A的构形，从而改变它们与操纵子的亲和力。

3 MMO的活性

3.1 铜离子对MMO活性的影响

辛嘉英等[21]从Methylosinustrichosporium IMV3011的膜中分离纯化出pMMO，发现铜离子浓度对纯化的pMMO有激活作用，对苯二酚能够作为pMMO有效的电子供体。van der Ha等发现[22]铜离子含量的增加对sMMO活性的增加没有影响，当铜离子的浓度达到0.64 mg/L时，对sMMO有抑制作用但对pMMO的活性有促进作用。sMMO和pMMO对NaCl保持不同的活性，这可能不是二者本身的性质导致的，而是由于二者位于甲烷氧化细菌中的不同位置导致的，pMMO嵌在细胞膜内部，细胞膜上的蛋白质会缓解盐浓度的增加，而sMMO在细胞质中因而缺少渗透性蛋白质的保护，但是目前没有相关的研究报道。

3.2 其他物质对MMO活性的影响

Yu等[23]用甲醇代替甲烷作为甲烷氧化细菌生长的碳源，烯丙硫脲虽然可以抑制pMMO的活性，但Methylosinus trichosporium OB3b仍然保持生长，sMMO的活性也不受影响。Miyaji等[4]的研究表明，过氧化氢酶可以增加pMMO的活性，H2O2可以作为pMMO的电子供体，产生的H2O2抑制了pMMO的活性。

4 结语

之前的30年间对MMO进行了一系列的研究，通过对其晶体结构的测定，在聚集体结构、金属中心的排列等方面取得了让人惊喜的进展，但还有很多方面仍然是未知的，例如MMO催化过程中的中间体P*、Q和H的结构究竟是什么样的、是什么构成了Q这样一个蛋白催化剂、为什么pMMO的结构是三聚体、为什么这个三聚体在中心处有一个开口等。

虽然有很多问题有待解决，但分光镜和高分辨率结晶学等手段的应用和发展，以及同位素效应实验、X线、量子力学的使用，为解决这些难题提供了有力的技术支持。对MMO很多方面的研究还处在初级阶段，未来应着重探讨MMO蛋白合成体的结构、pMMO催化甲烷氧化的关键步骤、sMMO的分子生物学特性，以及pMMO金属中心的生物学特性及其高活性的催化机制等方面。

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