不同年龄段小儿骨骼维生素K营养状况的评价与分析

金 轶

维生素K(vitamin K)是一类具有萘醌基团(2-甲基-1，4萘醌)的衍生物，在传统医学临床实践中，人们通过测定依赖维生素K的凝血因子或凝血酶原时间、部分凝血活酶时间、凝血试验等评价机体凝血功能状态的指标来反映维生素K的营养状况。但这些均为功能性指标，揭示临床水平的维生素K是否缺乏，一旦维生素K缺乏，则表明机体维生素K缺乏已达到严重程度。基于这些原因，通过“评价机体凝血功能状况”来反映维生素K营养状况的方法正逐步由“评估机体维生素K营养状况”所取代[1]。伴随着凝血酶原前体蛋白、骨钙蛋白(OC)等维生素K依赖蛋白的发现以及高效液相色谱检测技术的发展，逐步弄清了维生素K发挥生理作用的本质，使从生化水平了解机体维生素K营养状况成为可能。本研究应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定不同年龄组儿童血未羧化骨钙蛋白(UOC)和OC水平，计算出OC的未羧化率，并以此来揭示机体维生素K营养状况，以便预防因维生素K缺乏对小儿骨代谢造成的影响，为临床医生如何补充及应用维生素K提供了更好的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机抽取2012年1—5月于我院儿科首诊的0～14岁健康小儿62例，均无血液系统、肝脏系统疾病；未服用过影响维生素K代谢的药物，如双香豆素类抗凝剂、抗癫痫药、抗结核药、抗生素、阿司匹林等。按照年龄，将其分为5组：0～3个月为A组(13例)，>3个月～1岁为B组(9例)，>1～3岁为C组(13例)，>3～9岁为D组(14例)，>9～14岁为E组(13例)。

1.2 仪器及试剂盒 (1)仪器：全自动酶标仪(Wellscan MK3，芬兰)，全自动洗板机(DEM-Ⅱ型，北京)。(2)试剂盒：OC试剂盒为美国DSL公司的OC酶联免疫测定盒；UOC试剂盒为日本TakaRa公司的UOC酶联免疫测定盒(Glu-OC EIA Kit)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 所有小儿在上午8：00～9：00采集清晨空腹静脉血4 ml，不抗凝，待血液充分凝固后，于3 000 r/min离心5 min，分别留取血清，置-20 ℃冰箱保存待测。

1.3.2 操作步骤

1.3.2.1 OC的测定步骤 将待测标本置室温下复温、溶化、稀释，用辣根过氧化物酶标记的抗OC多克隆检测抗体孵育，孵育、洗板后用四甲基对二氨联苯(TMB)使之显色，酶作用物的酶转化程度用450 nm和620 nm处的双波长吸光度来测定。吸光度值与血清OC水平呈正相关。根据吸光度与OC水平的标准曲线，可以计算出未知标本的OC水平。

1.3.2.2 UOC的测定步骤 将待测标本置室温下复温、溶化，将标本、标准品滴定于覆被有鼠抗UOC的多克隆抗体的孔中孵育、洗板后，加入标记有过氧化物酶的二抗。孵育洗板后，加入TMB使之显色。酶作用物的酶转化程度用450 nm处的波长吸光度来测定。吸光度值与血清UOC水平呈正比。绘制吸光度与UOC水平的标准曲线，计算出未知标本的UOC水平。OC未羧化率(%)=UOC/OC×100%。

2 结果

2.1 各年龄组小儿UOC、OC及OC未羧化率比较 各年龄组小儿血清UOC、OC水平及OC未羧化率比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。其中A组UOC水平均低于其他各年龄组，差异有统计学意义(P<0.05)；E组OC水平均高于其他各年龄组，差异有统计学意义(P<0.05)；B、C、D组OC未羧化率均高于A组，且B组又高于E组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 相关分析结果 血清UOC、OC水平均与年龄呈正相关(r值分别为0.49和0.38，P均<0.01)；而OC未羧化率与年龄无线性相关关系(r=-0.48，P=0.71)。

表1 各年龄组小儿UOC、OC及OC未羧化率比较

注：UOC=未羧化骨钙蛋白，OC=骨钙蛋白；与A组比较，*P<0.05；与B组比较，△P<0.05；与C组比较，★P<0.05；与D组比较，■P<0.05

3 讨论

维生素K发现于20世纪30年代，既往人们认为其只参与凝血，但近十几年来研究发现，维生素K不仅与血液凝固有关，还参与骨代谢。1975年，Pettifor等[2]发现孕妇口服抗凝剂所产婴儿鼻骨发育不全，首次报道了维生素K缺乏对人体骨发育的影响，提出维生素K参与人体骨代谢的假说。从此，维生素K凝血以外的功能引起了人们的高度重视。

维生素K本身并不参与凝血因子的合成或具体的凝血过程，而是作为羧化酶的辅酶参与维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅻ、Ⅸ、Ⅹ的合成，催化某些蛋白质中的谷氨酸残基转化为γ-羧基谷氨酸残基，这类蛋白质又称为维生素K依赖性蛋白质。人体中维生素K依赖性蛋白质主要有3种，其中与凝血无关的是OC，所有种属OC的共同特点是在第17、21、24位上有3个维生素K依赖性γ-羧基谷氨酸残基。骨组织具有把谷氨酸残基羧化为γ-羧基谷氨酸残基的维生素K依赖羧化系统。未发生羧化反应的谷氨酸残基不具有结合钙离子的化学特性。因此机体内的OC有两种存在形式，即UOC和γ-羧化OC，通常提到的OC是指这两种形式OC的总和[1]。理论上，在维生素K充足，羧化酶功能正常的情况下，UOC完全转化为羧化OC。因此，根据UOC所占总OC的比例即OC未羧化率，可以计算出体内OC的未羧化程度，而OC的未羧化程度与维生素K对成骨细胞的供应量有关，这就是OC未羧化率用于反映机体成骨细胞是否缺乏维生素K的理论基础。由于不同实验室免疫动物所采用的OC抗原不尽相同，OC检测方法的标准化困难，影响因素多，故文献报道的OC数值变异很大[3]。有动物研究发现，相对较低的维生素K摄入量，凝血酶原的羧化就能达到最大程度，进一步增加维生素K摄入量，可使尿γ-羧基谷氨酸继续增高[4]，表明凝血因子以外的维生素K依赖性蛋白质尚未达到最大程度的羧化，OC羧化所需维生素K的含量更高[5]，维生素K缺乏的影响更易在骨代谢上表现出来[6]。

细胞培养证实OC的合成受维生素D与维生素K的共同调节，维生素D直接在基因转录水平发挥作用，维生素K参与蛋白质的翻译后羧化修饰过程[7]，而OC促进骨的矿化作用已经肯定，因此可以通过测定血清OC的未羧化率来评价机体的骨骼维生素K营养状况，有助于了解不同年龄段小儿骨代谢受维生素K影响的不同程度，以便更好地指导临床预防性用药。本研究将在我院就诊的62例健康儿童按年龄的不同分为5组，分别测定各组儿童的血清UOC、OC水平，从而计算OC未羧化率。结果显示，在儿童期UOC、OC水平随年龄变化呈动态演变的过程，0～3个月UOC水平显著低于其他年龄段小儿，>9～14岁OC水平显著高于其他年龄段小儿；>3个月～1岁、>1～3岁、>3～9岁小儿OC未羧化率均显著高于0～3个月小儿，且>3个月～1岁小儿OC未羧化率还显著高于>9～14岁小儿。这是不同年龄段小儿骨骼维生素K营养状态不同所致。这表明>3个月～1岁小儿成骨细胞的维生素K的相对缺乏程度较重，维生素K对骨骼的供应也就最为缺乏，与临床上该年龄段小儿最易发生骨代谢异常，易患佝偻病相吻合，在今后的临床工作中该年龄段小儿维生素K的预防性应用更应受到重视。

骨骼维生素K水平作为评价骨代谢的一项重要生化指标已经得到了确认，但在小儿阶段骨代谢受年龄增长、性别、生长速率、营养状况以及青春期阶段等更多因素的影响，因此对这个阶段的骨代谢进行评价及判断难度更大；同时本研究提醒在小儿不同的年龄段应确立不同的参考值，因此对骨骼维生素K更准确、简便的检测手段以及参考值的建立，还需要在以后的临床工作和实验中做进一步的探讨及研究。

1 张会丰，李伟.机体维生素K营养状况评价指标的研究进展[J].国外医学·卫生学分册，2001，28(5)：292-294.

2 Pettifor JM，Benson R.Congenital malformations associated with the administration of oral anticoagulants during pregnancy[J].J Pediatr，1975，86(3)：459-462.

3 Gundberg CM，Nieman SD，Abrams S，et al.Vitamin K status and bone health an analysis of methods for determination of undercarboxylated osteocalcin[J].J Clin Endocrinol Metab，1998，83(9)：3258-3266.

4 Craciun AM，Groenen-van Dooren MM，Vermeer C.Nutritional vitamin K-intake and urinary gamma-carboxyglutamate excretion on the rat[J].Binchem Biophys Acta，1997，1334(1)：44-50.

5 Sato T，Ohtani Y，Yamada Y，et al.Difference in the metabolism of vitamin K between fiver and bone in vitamin K-deficient rates[J].Br J Nutr，2002，87(4)：307-314.

6 陶天遵，杨小清，陶树清，等.维生素K与骨代谢[J].国外医学·内分泌学分册，2005，25(5)：298-301.

7 Auf′mkolk B，Hausehka PV，Schwartz ER.Characterization of human bone cells in culture[J].Calcif Tissue Int，1985，37(3)：228-235.