以酵母菌双杂合技术寻找志贺氏菌IpaH7.8作用蛋白质的目标蛋白

李思硕 简俊伊 程树德

以酵母菌双杂合技术寻找志贺氏菌IpaH7.8作用蛋白质的目标蛋白

李思硕 简俊伊 程树德

台湾阳明大学微生物及免疫学研究所

背景：志贺氏菌感染能造成人类出血性腹泻，此菌常带有一大型毒性质体，以携带第三型分泌系统及相关致病基因，并透过此系统释放作用蛋白，协助菌体侵入人类肠壁细胞，操控细胞功能，以利在细胞中存活及增殖。IpaH 家族蛋白是作用蛋白中较特别的一群，志贺氏菌常带有数个IpaH家族基因，除了在毒性质体上，经常同时存在染色体上。从蛋白质结构上来说，IpaH家族蛋白皆由两个功能性区域组成，其C端均为E3泛素连接酶，而N端在不同IpaH 家族蛋白则具有不同的白氨酸重复序列，可能结合不同的目标蛋白，最后将其泛素化。其中 IpaH4.5、IpaH7.8、IpaH9.8 在侵入宿主细胞后才释放；目前已有研究发现IpaH4.5和IpaH9.8的目标蛋白，其他IpaH蛋白的目标蛋白和功能则仍未知，因此我们希望利用酵母菌双杂合技术找出IpaH7.8的目标蛋白。方法：使用酵母菌双杂合系统筛选，接着将可能的候选蛋白，以其在细胞内的分布、伪阳性的可能性、与IpaH7.8交互作用的强度等，作进一步评估，最后以共同沉淀技术进行验证。结果：经酵母菌双杂合系统筛选后，我们得到6个候选蛋白，其中多数参与细胞的代谢反应。其中一候选蛋白-RAD50，主要分布在细胞核，而我们直接在细胞中表现IpaH7.8 N端和绿色萤光蛋白的融合蛋白，也发现绿色萤光聚集在细胞核，因此推测RAD50为候选蛋白的可能性最高。将IpaH7.8和RAD50进行共同沉淀，显示两者在生物体外的条件下可互相结合。

酵母菌双杂合技术 志贺氏菌IpaH7.8作用蛋白质 目标蛋白 共同沉淀法

志贺氏菌为人类的病原菌，当 10～100 个菌体感染人类时，即可能造成严重的出血性腹泻以及发炎反应[1]。其致病性来自毒性质体上所携带的第三型分泌系统 (Type III secre- tion system) 及相关致病基因[2]。包含这群基因的片段被称为进入区域 (Entry region)，当此区域内的转录活化因子 VirB (第二号毒性基因，Virulence B)受VirF (第六号毒性基因，Virulence F) 活化后，会启动进入区域的其他基因，以构成第三型分泌系统，同时也活化进入区域外的osp(外膜蛋白质，Outer membrane protein) 家族基因。部分osp家族蛋白已证实可被释放至宿主细胞，降低细胞的免疫反应，协助志贺氏菌的感染[3-4]。osp家族和ipaA、ipaB、ipaC、ipaD 基因属于感染初期 (菌体尚未进入细胞前) 最先被分泌的作用蛋白，当菌体进入宿主细胞后，IpgD会与MxiE结合，活化另一群作用蛋白的基因，包含部分osp家族，以及ipaH家族，这些作用蛋白被认为可抑制细胞的非专一性免疫反应，并减少受感染细胞的凋亡，帮助细菌在宿主细胞内存活[5]。

IpaH家族基因在1987年被发现，在众多作用蛋白当中，IpaH是唯一具有多套(multi-copy)基因的蛋白[6]，且此家族同时存在毒性质体，以及细菌染色体上。在已定序的志贺氏菌株中，有5个ipaH家族基因经常出现，总基因数目则因菌株不同而稍有差异[7]，因此Sasakawa等人认为此作用蛋白可能具有重要的功能[8]。

IpaH 蛋白约为 60 kD，从结构上可分为 N 端和 C 端两部分：N 端具有白胺酸重复序列 (Leucine rich repeat，LRR)，这样的重复序列常被用来与其目标蛋白结合，不同 IpaH 的 N 端则带有不同的重复序列；IpaH 家族的 C 端序列则几乎是相同的，且被发现具有E3泛素连接酶 (E3 ubiquitin ligase) 的功能[9]。综合上述推测，IpaH 家族的不同成员，可能具有将其目标蛋白泛素化的功能[10]。

Sasakawa等人在2005年发现，IpaH9.8会进入细胞核，借由和U2AF35结合，影响mRNA的剪接作用 (splicing)，使mRNA无法成熟(maturation)，进而影响介白素8 (interleukin-8)、趋化素 (Regulated upon Activation, Normal T-cell Expressed, and Secreted，RANTES)、颗粒单核球群落刺激生长因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF) 和介白素 1β (interleukin-1β)，以抑制宿主细胞的免疫反应[11]；相同团队在2010年又发现IpaH9.8可和细胞质中的NEMO和ABIN两个蛋白质结合，NEMO为NF-κB复合物的前驱物IKKα-IKKβ 的结合蛋白，IpaH9.8 可将 NEMO 泛素化，促使其降解，进而抑制IL-6的分泌，降低免疫反应[12]。

此外，Fernandez-Prada等在 2000 年将志贺氏菌接种至天竺鼠眼球(Sereny test)，观察正常基因型，或分别具有 ipaH4.5或ipaH7.8 基因缺失时，对天竺鼠眼球发炎的影响，结果发现ipaH4.5或ipaH7.8基因缺失皆增强发炎反应，且 ipaH4.5和ipaH7.8同时剔除将更加剧烈；此论文并未探讨其作用机制，但由此推测，IpaH7.8可能也和抑制发炎反应有关。其他研究中则指出，IpaH7.8会促使吞噬细胞的凋亡，调控机制仍不清楚[13]。

最近，北京军事医学科学院疾病预防控制所王芳博士的论文《志贺氏菌Ⅲ型分泌系统效应子蛋白 IpaH4.5功能研究》，也以酵母菌双杂合技术为基础，发现其目标蛋白为p65，借此降低宿主细胞的免疫反应[14]。

本研究以酵母菌双杂合技术找寻IpaH7.8可能的结合蛋白，期望能找到参与免疫反应路径的候选蛋白。

1 材料与方法

1.1 菌株和细胞株

E. coli 由益生生技公司购买，DH5α菌株作为胜任细胞和质体增殖用，BL21菌株用以生产重组蛋白。酵母菌由阳明大学郑明媛教授馈赠，菌株 Y187 (MATα，ura3-52，his3-200，ade 2-101，trp 1-901，leu 2-3，112，gal4D，met，gal80D，URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-Lac，MEL1)，菌株 PJ69-2A，(MATa， trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4D，gal80D，LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3，GAL2UAS- GAL2TATA-ADE2，MEL1)。人类均质化互补型去氧核糖核酸基因库 (normalized cDNA library) 由 Clontech 公司购买。HeLa 细胞株由阳明大学林奇宏教授馈赠。

1.2 使用基因序列以及质体

IpaH7.8 基因由 Shigella flexneri 2457T 经聚合链酶连锁反应(PCR)取得。于大肠杆菌表现重组蛋白之质体 pTAC- MAT-Tag2由Sigma公司购买。酵母菌表现用质体 pACT-2、pAS2-1、pGBP-9由阳明大学郑明媛教授馈赠。细胞表现用质体 pEGFP-N2 由阳明大学林奇宏教授馈赠。

1.3 菌种培养

大肠杆菌菌株皆以 Luria broth (LB) 培养基于 37℃ 恒温培养箱培养，制成洋菜平板 (agar plate) 时则外加 1.2洋菜胶 (agar) 并视需要添加抗生素：ampicillin (50μg/mL) 或 kanamycin (30μg/mL)。如需 IPTG 诱导，细菌先培养于外加 0.5glucose 及 0.5yeast extract 之 M9 培养基，隔夜后再 1：1 稀释至含 1mM IPTG 之 LB 培养基，于 37℃ 培养 2 小时。

1.4 共轭焦显微镜观察

使用 T-Pro Biotechnology 公司之T-Pro Non-liposome Transfection Reagent 进行转染，经 12～18 小时后，抽去细胞之培养液并以 3.7的福马林溶液 (formaldehyde) 固定，室温静置15分钟，吸去福马林，再以 PBS 缓冲液冲洗两次，最后利用 Leica SP5 共轭焦显微镜观察。

1.5 重组蛋白纯化

将IpaH4.5或IpaH7.8 接入 pTAC-MAT-Tag2 使其带有MAT-tag，并转型至 BL21 菌株，经 IPTG 诱导表现后，离心去除培养液，再使用裂解溶液 (lysis buffer：triton X100 1% PMSF 50mM 之 PBS 溶液) 悬浮，利用法式细胞破碎仪 (French press) 打破菌体，接着离心取上清液，通过 His-Trap FF 管柱纯化。

1.6 HeLa 细胞溶解物 (cell lysates)

将10公分培养盘之培养液抽去，以PBS溶液冲洗后，加入 200μL RIPA裂解液，刮下细胞，经 4℃、14000 rpm 离心10分钟，取上清液使用。

1.7 共同沉淀法

使用 TAN Beads公司之His Mag磁珠，经 RIPA裂解溶液清洗两次，并悬浮在 RIPA 裂解溶液，再和重组蛋白混合，于 4℃缓慢摇动30分钟后，离心去除上清液；接着将带有重组蛋白之磁珠加入细胞裂解物中，经4℃缓慢摇动1小时后，离心去除上清液，并以样本缓冲液 (sample buffer) 将磁珠悬浮，以100℃沸水加热5分钟后置冰上冷却。最后离心去除磁珠，取上清液进行西方墨点法分析。

1.8 酵母菌双杂合系统

使用 Y187和PJ69-2A 两菌株，其中 Y187 为α型，而 PJ69-2A是a型；两菌株皆无法生长在缺少白胺酸 (leucine)、色胺酸(tryptophan)、腺嘌呤 (adenine)、组胺酸 (histidine) 的培养基上。本研究中所使用的 pGADT7 质体带有 leu2 基因，可使酵母株生长在缺少白胺酸的培养基上；pAS2-1 和 pGBT9 质体则带有 trp2 基因，可使酵母菌生长在缺少色胺酸的培养基上。将猎物蛋白和饵蛋白分别接入其中一个质体，并分别转型至 Y187 或 PJ69-2A，经交配后，以同时缺少白胺酸和色胺酸的培养基筛选，即得同时带有两个质体的二倍体。若猎物蛋白和饵蛋白可进行交互作用，则菌株可开启质体上的下游基因，进一步生长在缺乏腺嘌呤和组胺酸的培养基，若交互作用较强，还可使菌落在含X-α-gal 的培养基上呈蓝色。

1.9 酵母菌培养

一般培养使用 YPAD 培养液；SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu (2SD)、SD/-Trp-Leu-His-Ade (4SD) 培养液分别用于筛选转型后，或交配后可生长于缺乏特定营养源的菌株。X-α-gal (4mg/mL) 则视需要添加。

1.10 酵母菌转型

酵母菌经 30℃隔夜培养后，重新接种，于30℃培养至 OD600达0.4～0.6，离心去除上清液，以无菌3次水清洗，再离心去除上清液后，以 TE/LiAc 缓冲液清洗，再离心后悬浮于 TE/LiAc 缓冲液，即为酵母菌胜任细胞；使用1.5mL胜任细胞，加入150～200μg carrier DNA 和10～50μg质体，以及6mL含40PEG3350的TE/LiAc 缓冲液，在30℃培养箱缓慢摇动30分钟，再加入700μL DMSO，并于42℃水浴15分钟，最后离心去除上清液，以无菌三次水悬浮，并涂抹在缺乏特定营养源的培养基上。

1.11 酵母菌交配

将具有饵蛋白质体的酵母菌株接种至100mL的 SD/-Trp 培养液中，30℃隔夜培养，接着离心并重新悬浮为5mL体积，再和OD600约100的带有猎物蛋白质体之酵母菌1mL混合，并加入45mL YPAD培养液，在30℃培养箱中培养20～24小时。取少量经连续稀释后涂抹在培养机上，以计算交配效率，其余则涂抹于缺乏特定营养源的培养基。

1.12 酵母菌菌落聚合酶链锁反应

将酵母菌菌落挑入 30μL 0.2SDS溶液中，震荡15秒后，马上以95℃隔水加热4分钟，于室温冷却后，离心取上清液稀释10倍为DNA样本。PCR包含一组TUB1引子作为阳性控制组，一组 GAL4 引子确认饵蛋白质体，及一组 cDNA 用引子获得基因库嵌入片段。

2 结果

2.1 酵母菌转型及交配效率

酵母菌交配完成后，经连续稀释，将菌液分别涂在 YPDA、SD/-Leu、SD/-Trp、2SD 上，以计算交配效率，回推所得的二倍体数目约16000个。进一步筛选有交互作用者，得到264个阳性菌落，再经由酵母菌菌落聚合链酶连锁反应确认，得到68个菌落带有cDNA资料库嵌入片段。进一步分析嵌入片段长度，并利用限制酶处理，区分不同嵌入片段，最后选出28个不同的cDNA嵌入片段。

2.2 候选蛋白筛选

经定序后发现，并非所有嵌入片段都和活化区域属于同一开放阅读框架 (open reading frame)，因此最后得到 6 个可转译出长片段的候选蛋白 (见表1)。

表1 利用酵母菌双杂合系统所得 6个可转译出长段的候选蛋白（其中部分候选蛋白仅包含全长 cDNA 之一部分）

为进一步分析交互作用强度，我们分别制作带有 pAS2- 1-IpaH7.8N(高量表现IpaH7.8 N端的质体)、pGBT9- IpaH7.8N (低量表现IpaH7.8 N 端的质体)、pGBT9-IpaH7.8 (低量表现 IpaH7.8全长的质体) 的酵母菌株，与带有候选蛋白质体的酵母菌株进行交配。

若交配后仅表现his3基因，会因生成腺嘌呤的前导物累积，而呈现红色菌落，我们将此状况的交互作用的强度定为 1 分；若可开启his3和ade2两基因，则菌落呈现白色，定为 2 分；若可开启his3、ade2、mel1三个基因，则可在含 X-α-gal 的培养基上呈现蓝色菌落，定为3分。结果显示候选蛋白中的 WBP5 和 OLFML3与IpaH7.8 N 端有最强的交互作用 (见图1)。

红色菌落 1 分开启 his3 白色菌落 2 分开启 his3 + ade2 蓝色菌落 3 分开启 his3 + ade2 + mel1

2.3 IpaH7.8 与候选蛋白在细胞中的分布

在真实的情况下，若两个蛋白发生交互作用，则需同时出现在细胞的相同区域。因此我们分别在 HeLa 细胞株直接表现与绿色萤光蛋白融合的全长 IpaH7.8，或只有 IpaH7.8 N 端，并利用共轭焦显微镜确认。结果表现全长的融合蛋白时，萤光强度偏低，难以判读，但表现 IpaH7.8 N 端的融合蛋白时，绿色萤光有聚集在细胞核的现象 (图2)。接着，我们查询基因本体 (Gene Ontology) 系统中对候选蛋白在细胞中分布的描述，发现其中 RAD50 会出现在细胞核。

图2 在 HeLa 细胞中直接表现 IpaH7.8 N 端和绿萤光蛋白的融合蛋白，显示绿色萤光聚集在细胞核中。左为相位差影像，右为绿色萤光影像。

2.4 以共同沉淀法验证候选蛋白

我们进一步在候选蛋白的N端接上FLAG标记，转染入 HeLa细胞表现，另一方面利用大肠杆菌生产带有MAT 标记的IpaH7.8的重组蛋白，以共同沉淀法验证两者在生物体外的环境下是否发生交互作用。由西方墨点法结果显示，含有 IpaH7.8的重组蛋白的确可和RAD50结合，而改以IpaH4.5 重组蛋白取代，便无法得到RAD50 (见图3)。

RAD50 Mock IpaH7.8IpaH4.5 IpaH7.8IpaH4.5 Total lysateSupernatantPelletSupernatantPellet Total lysateSupernatantPelletSupernatantPellet Anti Flag-Tag Anti tubulin

3 讨论

从交互作用强度、候选蛋白在细胞中的分布、共同沉淀等结果来说，在我们的候选蛋白中，RAD50是可能性最高的。过去研究指出，RAD50会与MRE11和NBN 蛋白形成复合物[15]，辨认DNA双股断裂处，进行 DNA 修复，同时也会透过 ATM 蛋白调控细胞周期，使细胞停留在DNA 合成期 (S phase) 之前[16]。若RAD50受IpaH7.8的结合并接上泛素，可能会改变其功能，或吸引其他因子与RAD50结合[17]，而停止细胞周期。如志贺氏菌的另一个分泌蛋白 IpaB，可透过与Mad2L2的作用，使宿主细胞的细胞周期停止，避免宿主细胞内的志贺氏菌因细胞分裂而有机会被排除在细胞外[18]。

我们原先希望在候选蛋白中看到参与调控免疫机制的蛋白，但最后并未发现，从酵母菌双杂合技术层面来说，可能一开始筛选得的二倍体数目并未完整涵盖人类的转录体 (transcriptome)，因而错失真正的目标蛋白，或者其目标蛋白在酵母菌表现后影响酵母菌生长，而难以被培养出，这两点也是酵母菌双杂合技术经常遇到的基本问题；此外，也可能 IpaH7.8并不直接调控免疫反应，而是透过其他途径间接影响。若多重复此实验，收集更多候选蛋白加以分析，或有较多机会发现IpaH7.8在细胞中的目标蛋白。

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