复方黄柏颗粒对养殖场常见致病菌的体外抑菌实验

陆黎明



复方黄柏颗粒对养殖场常见致病菌的体外抑菌实验

陆黎明

厦门泰枫牧业科技有限公司

本研究的目的是为了探讨新型复方中兽药复方黄柏颗粒对养殖场中常见致病菌的体外抑菌效果，结果表明：复方黄柏颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、甲型副伤寒沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌的最小抑菌浓度（MIC）分别为15.625 μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL，最小杀菌浓度（MBC）分别为>1000μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、1000μg/mL，抑菌圈直径呈浓度依赖关系，与MIC结果基本吻合。复方黄柏颗粒具有明显的抑菌效果，同时也为其使用提供了理论依据。

中兽药 复方黄柏颗粒 抑菌 杀菌

使用抗生素、生长促进剂等对畜禽虽具有较满意的生长速度，但各种疾病疫病的发生层出不穷，数量明显增多，而且没有传统意义上的典型症状[1]。全球范围内有耐药性的微生物通过动物食品转移到人体内，产生二重感染，从而影响人体健康，世界卫生组织（WHO）、欧洲联盟委员会、美国食品和药品管理局（FDA）等机构均相继出台了各种各样限制或限量药物使用的法令。

将传统中医药理论与现代科技相结合制成的中药提取液，正成为兽药中的新亮点，无抗药性、无药物残留，堪称新一代高效绿色兽药[2]。大量科学实验证明，许多中草药不仅本身具有良好的抗菌、抗病毒作用，更可以增强机体器官和组织的屏障防御功能，增强机体的免疫功能，调节微生态，促进微循环，调整和提高机体抗病修复功能和抗病防御功能，达到标本兼治、全面增强体质的目的。这种独特的作用，“头疼医头、脚疼医脚”的西药是无法相提并论的[3]。

复方黄柏颗粒主要是由黄柏、秦皮、白头翁等中草药组成，本研究通过体外抑菌试验阐明复方黄柏颗粒对临床常见致病菌的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试验仪器

超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱、普通冰箱、电子天平（0.1mg）、游标卡尺（规格0.02mm）、麦氏比浊管、一次性0.22μm微孔滤器（爱尔兰Millex公司）、磁力搅拌器、pH计。

1.2 试验材料

1.2.1试验菌种

金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌、嗜水气单胞菌、甲型副伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌。

1.2.2试验药品

复方黄柏颗粒剂：主要原料为黄柏、秦皮、白头翁等中草药，药材购自福建回春中药材公司，应用中药多功能提取器，采用减压控温方法，55℃～60℃、-0.05MPa（低压）条件下水煮、醇提、浓缩，过滤成浸膏，然后经过加入载体淀粉（1:1）混合、烘干、粉碎而成，精制后的颗粒剂1g成品相当于原生药0.65g。由实验室自行制备。

营养琼脂、营养肉汤：北京陆桥技术有限责任公司。按说明书配制备用。

1.3 试验方法

1.3.1试验用致病菌菌液的制备

取灭菌生理盐水5mL左右在灭菌试管中，挑取平板分离4~5个菌落，置于生理盐水中，振荡混均后与麦氏比浊管相对比，调整浊度与比浊管相同，此菌液的细菌相当5×107~108CFU/mL。

1.3.2最小抑菌浓度（MIC）的测定

采用试管内药液倍比稀释法，即肉汤稀释法。供试品的第1~10管的浓度以每毫升培养液所含的复方黄柏颗粒量计。第11管为阳性生长对照管。第12管为培养基对照管。分别将已制备好的金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌、嗜水气单胞菌、甲型副伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌五种新鲜菌液各0.05mL分别接种于各排1~11管。立即将样品的所有试管放入37℃培养箱内孵育24h，取出各试管，阴性对照与阳性对照均准确无误后，再读取MIC值：以肉眼可见细菌生长的最低药物浓度作为药物对该菌株的MIC。分别记录各菌株的MIC值。

1.3.3最小杀菌浓度（MBC）的测定

先测出试验菌的MIC，再依次将未见细菌生长各管培养液分别吸取0.1mL，转移到无菌新鲜的琼脂平皿中，置37℃培养箱内孵育24h后观察结果，平皿上菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为MBC。

1.3.4抑菌圈的测定与观察

用灭菌的棉拭子蘸取制备接种菌液，均匀涂布培养基的表面。在无菌条件下，用打孔器在接种后的培养基表面水平轻轻放上不锈钢小管，静置20min，在小管内注入0.3mL初始稀释浓度至最小抑菌浓度的药液，盖上灭菌瓦盖，立即水平放入37℃培养箱孵育24h，观察复方黄柏颗粒的MIC对五种细菌的抑菌圈，并用游标卡尺测量其直径。

2 结果与分析

2.1 最低抑菌浓度（MIC）的测定

37℃培养24h后，各组11号阳性对照管，细菌生长良好，液体变为黄色。12号阴性对照管，无细菌生长，液体仍保持培养基原有颜色。

金黄色葡萄球菌组第1~7，埃希氏大肠杆菌和嗜水气单胞菌第1~4，甲型副伤寒沙门氏菌组第1~6，多杀性巴氏杆菌组第1~5支试管澄清，未见细菌生长所致培养基混浊现象，其余试管均呈不同程度黄色和混浊现象。

复方黄柏颗粒对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、甲型副伤寒沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌的MIC分别为15.625μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL，见表1。

2.2 最低杀菌浓度（MBC）的测定

在该稀释度范围内，除金黄色葡萄球菌，其他各菌均可见不同程度的杀菌作用。复方黄柏颗粒金黄色葡萄球、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、甲型副伤寒沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌的MBC分别为>1000μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、1000μg/mL，见表2。

表1 复方黄柏颗粒对五种细菌体外的MIC (μg/mL)

注：“—”代表培养基澄清，不长菌，“+”代表培养基浑浊，长菌。

表2 复方黄柏颗粒对五种菌的MBC(μg/mL)

2.3 抑菌圈的测定与观察（见表3与图1）

表3 复方黄柏颗粒对五种菌的抑菌圈直径（mm）

图1 复方黄柏颗粒的抑菌圈

复方黄柏颗粒对这五种致病菌的MIC分别为15.625μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、31.25μg/mL、62.5μg/mL，MBC分别为>1000μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、250μg/mL、1000μg/mL。实验表明，使用复方黄柏颗粒针对细菌性特别是肠道致病菌的疾病，有不同程度的疗效。通过MIC和抑菌圈直径可以发现复方黄柏颗粒的抑菌效果依次是：金黄色葡萄球、甲型副伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和嗜水气单胞菌。

3 讨论

白头翁对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、痢疾杆菌有抑制作用，大剂量能抑制阿米巴滋养体生长。黄柏对痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌等均有抑制作用，对流感病毒、钩端螺旋体、阿米巴原虫及皮肤真菌亦有抑制作用。秦皮对痢疾杆菌、伤寒杆菌、肺炎双球菌、甲型溶血性链球菌有较强抑制作用，并有杀阿米巴原虫的作用4,5]。肖金英等试验证明黄柏对金黄色葡萄球菌有抑制作用[6]；刘志春等研究发现秦皮对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌都具有抑菌作用，黄柏对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌都具有抑菌作用，而对绿脓杆菌无抑菌作用[7]；马廉兰等发现秦皮对常见福氏痢疾杆菌和伤寒杆菌具有抑菌作用[8]。实验证明，白头翁根的三种不同提取物原白头翁素、白头翁总皂苷、白头翁浸膏均有不同程度的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌较为敏感，对大肠杆菌作用相对较弱[9]。徐艺等研究表明，脾胃病常用方剂中左金丸、香连丸有较强抑菌作用，显示出一定的根治幽门螺旋杆菌（HP）的作用，提示根治HP并非只能依靠清热解毒药，辨证施治，合理组方也可起到很好的根治HP效果[10]。刘玉芹等证实清热类中草药板蓝根、连翘、败酱草对大肠杆菌O149K88都显示出不同程度的体外抗菌活性，由它们组成的复方的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度较单味药均有所增强，表明这几味中草药在抗菌活性方面具有协同作用[11]。

将各味中药进行组方，即相当于药理中的联合用药，目的主要在于扩大抗菌谱、增强疗效、减少用量、降低或避免毒副作用，减少或延缓耐药菌株的产生。试验表明，复方黄柏颗粒对养殖上常见的致病菌能够有效地表现出较强的抑菌和杀菌活性，为临床作为中兽药治疗使用或作为中草药饲料添加剂日常使用提供了有效的理论依据。

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