小活络丸中非法添加松香酸的检查方法研究

2013-05-26 07:57张亚双闵春艳

中成药 2013年4期

关键词：活络乳香质谱

张亚双，闵春艳

（苏州市药品检验所，江苏苏州 215104）

小活络丸中非法添加松香酸的检查方法研究

张亚双，闵春艳*

（苏州市药品检验所，江苏苏州 215104）

目的建立小活络丸中非法添加松香酸的HPLC检查法，并以HPLC/MS法加以验证。方法选用Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm ×250 mm）；TURNER C18（100A，5 μm，4.6 mm×250 mm）3三种色谱柱，二极管阵列检测器（PDA），乙腈－0.1%甲酸溶液（75∶25）为流动相等度洗脱，柱温20℃，体积流量1 mL/min，检测波长241 nm（190～300 nm）。通过比对供试品与对照品HPLC色谱及光谱，对小活络丸中是否非法添加松香酸作定性分析。结果小活络丸供试品中均检出松香酸。结论本方法灵敏度高、准确性好，操作简单，可用于小活络丸中非法添加松香酸的定性检查。

小活络丸；松香酸；高效液相色谱；二极管阵列检测器

小活络丸方剂中有制川乌、制草乌、胆南星、乳香（制）、没药、地龙，载于宋代《太平惠民和剂局方》，有祛风散寒除湿、化痰、活血功效，用于治疗风寒湿痹所引起的经络不通，肢体关节疼痛，关节屈伸不利、麻木拘挛，及中风手足不仁等症［1］，此外有研究表明小活络丸还具有较强的抗炎、镇痛作用［2］。

方中乳香、没药富含挥发油［3］，二药并用为宣通脏腑，流通经络之要药，主产于索马里、埃塞俄比亚、利比亚、苏丹、土耳其等国家［4］，国内对其疗效及活性成分进行了大量研究。近年来随着药材价格上涨，市场上出现了乳香、没药的伪药及劣药，如掺石膏粉等，杨秀泽等研究了其相应的鉴别方法［5-6］，其中掺入松香的乳香没药伪品引起了我们的注意，松香的主要成分为松香酸酐和游离松香酸，有小毒［7］。有报道称，银屑敌胶囊因非法添加松香酸而导致服用者视力下降、死亡等严重后果。夏小中等研究了药材中非法添加松香的理化及薄层色谱鉴别方法［8］，李丽在麝香接骨胶囊中检出松香酸并建立了相应的HPLC检查法［9］。小活络丸中乳香、没药经过炮制和粉碎，理化鉴别效果不佳，薄层色谱鉴别中检出可疑斑点，疑为松香酸，因此建立了HPLC法检测小活络丸中非法添加的松香酸，采用二极管阵列检测器（PDA）确定结果，采用UPLC-MS加以验证［10］。

1 仪器和试药

1.1 仪器 SHIMADZU LC-20AD SlutionHPLC，二极管阵列检测器，METTLER TOLEDO电子天平。

1.2 试药松香酸由A Johnson Matthey公司提供，批号为42582，小活络丸供试品为 A公司（大蜜丸）批号101002、B公司（浓缩丸）批号62101204及C公司（浓缩丸）批号10C10。乙腈（色谱纯，TEDIA公司），甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），水为超纯水。

2 实验条件与方法学考察

2.1 色谱条件［11］Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；TURNER C18100A（5 μm，4.6 mm×250 mm）3种色谱柱，二极管阵列检测器，乙腈－0.1%甲酸溶液（75∶25）为流动相等度洗脱，柱温20℃，体积流量1 mL/min，检测波段为190～300 nm（色谱提取波长为241 nm），进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备精密称取松香酸对照品10 mg置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备取小活络丸供试品大蜜丸3丸，加硅藻土适量，碾匀研细或取浓缩丸10丸研细，置锥形瓶中，加甲醇35 mL，超声处理30 min（250 W，33 kHz），离心，取上清液，0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.4 阴性干扰考察取不含松香酸的的阴性样品（按供试品制备方法制备），采用 TURNER C18100A（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱依法测定，结果阴性样品在松香酸峰相应位置上无吸收峰，表明小活络丸的方剂中的药物组分对松香酸的测定无干扰，见图1。

图1 松香酸对照品（A）、检出松香酸小活络丸样品（B）及不含松香酸样品（C）HPLC色谱图

2.5 方法耐用性考察选取不同型号的色谱柱：（031号柱）Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；（032 号柱）Inertsil ODS-3（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；（075 号柱）TURNER HPLC Columns C18（5 μm，4.6 mm ×200 mm），按上述测定法测定A公司生产小活络丸（大蜜丸，批号：101201）供试品溶液。松香酸特征峰分离度良好，能满足实验要求，方法耐用性好，见图2。

图2 小活络丸中松香酸系统适用性试验

2.6 线性关系考察取松香酸对照品6.41 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取1、3、7、10、15、20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以各自的峰面积对其注入质量数（mg）进行线性回归，回归方程为Y=155 073.0 X －90 461.99，R2=0.999 9，结果表明在1.153 8～23.076 μg范围内，松香酸峰面积与其质量呈良好线性关系。

2.7 定量限将1.153 8 mg/mL的对照品溶液分别以1、3、5、7、10、15、20 μL进样，根据峰高以信噪比 S/N=10确定松香酸的定量限为26.809 μg。

2.8 检测限同定量限测定方法，根据峰高以信噪比S/N=3确定松香酸的检测限为8.847 μg。

3 实验结果

取3个不同厂家生产的小活络丸供试品，按2.3项供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，采用TURNER C18100A（5 μm 4.6 mm×250 mm）色谱柱按2.1项色谱条件进行测定，测定结果见表1，松香酸对照品与3批供试品的HPLC图谱及相应光谱图见图3。

表1 小活络丸中非法添加松香酸测定结果

图3 小活络丸中非法添加松香酸HPLC图谱及相应光谱图

4 小活络丸中非法添加松香酸的质谱验证

4.1 试验仪器 Waters ACQUITY UPLC Xevo TQ液质联用色谱仪

4.2 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸溶液（A）；0.1%甲酸乙腈（B）溶液按表2梯度洗脱。

表2 小活络丸中松香酸液质联用分析流动相梯度洗脱

质谱条件：离子化模式ESI+；毛细管电压3.0 KV；源温度150℃；脱溶剂气温度500℃；雾化气体积流量900 L/h；采集参数如表3所示。

表3 小活络丸中松香酸质谱分析采集参数表

4.3 质谱验证结果本实验采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）技术对上述松香酸检验结果进行验证，利用液相保留时间（RT=1.79min）和松香酸正离子（［M+1］+=303.17）模式下不同碰撞能量产生的3个特征子离子（257.21，123.12和105.04）来判断是否含有松香酸，UPLC-MS具有高效、精确、分离效果好等优点［12］，结果显示能够对松香酸进行定性定量验证。结果如表4及图4～图7所示，供试品中均检出与松香酸对照品相同的3个特征子离子，即检出松香酸。