叶酸受体α在原发性肝癌组织及细胞中的表达

张艳杰 胡立华 陈鹏 冯春 刘鑫

叶酸受体α(folate receptor alpha，FRA)是一种糖蛋白，其蛋白分子以糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜上，主要介导叶酸入胞主动转运［1］。FRA在正常组织中几乎不表达，而在多种上皮组织来源的肿瘤组织中高表达，如鼻咽癌、非黏液性卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌及胰腺癌等。本实验研究FRA在原发性肝癌组织及细胞中的表达情况，为原发性肝癌的靶向治疗奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2006～2011年我院和黑龙江省医院手术切除的原发性肝癌及肝活检诊断的原发性肝癌标本45例，其中男28例，女17例，年龄33～75岁，平均58.3岁，按2010年巴塞罗那临床肝癌分期，早至中期33例，进展期12例，所有患者均未接受任何抗肿瘤治疗，病理类型均为肝细胞性肝癌。肝硬化标本为同期肝活检标本32例，其中男22例，女10例，年龄36～70岁，平均56.7岁。来源于肝血管瘤、肝囊肿周围2 cm以外及外伤性肝切除的正常肝组织标本20例，其中男6例，女14例，年龄23～70(平均43.5)岁。原发性肝癌细胞系HEPG2和宫颈癌细胞系Hela购自黑龙江省肿瘤医院肿瘤研究所，常规方法复苏，15%胎牛血清RPMI1640培养液、37℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养，0.25%胰酶消化传代。

1.2 主要试剂 叶酸受体α单抗购自深圳晶美生物工程有限公司，SP免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。

1.3 检测方法 将原发性肝癌细胞及宫颈癌细胞爬片固定，原发性肝癌、肝硬化及正常肝组织的石蜡标本重新制备切片，常规二甲苯脱蜡，热修复处理后采用免疫组织化学SP法检测，具体操作按说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 以细胞膜被染成棕黄色为阳性细胞，随机计数10个高倍镜视野下的细胞，按照阳性细胞数占全部细胞的比例分为:(-)阳性细胞﹤5%;(+)阳性细胞5% ～25%;(++)阳性细胞25% ～75%;(+++)阳性细胞﹥75%。

1.5 统计学方法 采用SPSS软件进行统计学处理，计数资料的组间比较采用卡方检验，临床病理资料分析采用Fisher's确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1 叶酸受体α在原发性肝癌、肝硬化及正常肝组织中的表达(例，%)

2.1 叶酸受体α在原发性肝癌、肝硬化和正常肝组织中的表达 免疫组化染色结果显示88.9%的原发性肝癌组织表达叶酸受体α(40/45)，其中强阳性12例，阳性18例，弱阳性10例;肝硬化组织中仅6例(18.8%)表达叶酸受体α，其中阳性2例，弱阳性4例;而正常肝组织中未见叶酸受体α表达(0/20)，差异具有统计学意义，(χ2=59.623，P ＜0.001)见表 1。进展期原发性肝癌组织中叶酸受体α阳性比例高于早-中期原发性肝癌组织，而与性别、年龄等因素无明显相关性，见表2。

表2 叶酸受体表达与原发性肝癌临床和病理特征的关系(例，%)

2.2 叶酸受体α在原发性肝癌细胞中的表达 免疫组化染色结果显示:叶酸受体α在原发性肝癌细胞呈强阳性表达，原发性肝癌细胞膜上呈现棕黄色染色，其表达水平与已知高表达的Hela细胞相当。

3 讨论

叶酸是一种人体必需的水溶性维生素，是包括核苷酸从头合成在内的一碳单位转移反应的辅因子，在涉及DNA及RNA合成、表观遗传过程、细胞增殖与生存的代谢过程中扮演关键角色。研究表明，叶酸缺乏与DNA损伤、甲基化畸形密切相关，而后者是肿瘤发生的重要环节。叶酸受体是细胞膜表面糖基化的磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白，可与5-甲基四氢叶酸及游离叶酸特异结合，并且通过受体介导的胞吞机制将叶酸及其衍生物高效、特异的载入细胞［2］。叶酸受体有α、β、和γ三种亚型，FRA分子量为38000 ～40000 mr，含有257个氨基酸，与叶酸具有高度亲和力。目前研究发现，FRA在正常组织中几乎不表达，而在多种上皮组织来源的肿瘤组织中高表达，且与肿瘤病理特征有一定联系［3，4］。

目前，已有学者利用叶酸对叶酸受体的高度亲和性，将分子影像探针与叶酸偶联，靶向至肿瘤组织，对小鼠的肿瘤组织进行了成功的核磁共振分子显像用于肿瘤的诊断［5］。原发性肝癌(primary carcinoma of the liver)是指由肝细胞或肝内胆管细胞发生的肿瘤，是我国常见的恶性肿瘤之一。原发性肝癌早期症状隐匿，病史较长，不易被及时诊断。临床多见诸多患者到了疾病晚期出现严重的并发症如:消化道出血、肝性脑病、顽固性腹水、肝癌破裂、肝肾、肝肺综合征等才得以就医。这时往往失去了最佳治疗时机，不仅疗效极差，而且给患者及家属在经济和思想上带来极大负担。因此提高原发性肝癌的早期诊断率及提高治疗效果意义非常重大。目前原发性肝癌诊断主要依据甲胎蛋白升高及彩超、CT和/或MRI等影像学方法。但对于小肝癌和早期肝癌影像学诊断率低，多采用肝活检行病理组织学诊断，但不易为患者接受。核磁共振分子显像是近年来出现的新技术，对早期实体肿瘤的诊断具有重要意义。本研究表明，叶酸受体α在原发性肝癌组织及细胞中高表达，且临床分期晚的原发性肝癌叶酸受体阳性率更高，这与其他学者对子宫内膜癌、肺癌的研究结果一致［6，7］，为利用叶酸受体靶向磁共振诊断早期原发性肝癌提供依据。

另外，由于叶酸与其受体具有高亲和力、自身稳定性高、低免疫原性、低分子质量、无需修饰，与有机物和无机盐均有良好的相容性等优点，而成为肿瘤靶向的理想配体。如今，很多化学的、生物的治疗剂已成功地包载入叶酸，提高其在叶酸受体阳性肿瘤细胞的转运。本研究表明，叶酸受体α在原发性肝癌组织及细胞中高表达，利用叶酸受体与叶酸的高亲和力，应用包载入叶酸的制剂治疗原发性肝癌可大大提高疗效，减少副反应。

综上所述，叶酸受体α的表达与原发性肝癌的发生、发展有密切关系，为利用叶酸受体靶向磁共振诊断早期原发性肝癌提供了理论基础，并且可能为原发性肝癌的治疗提供新视角。

［1］Spinella MJ，Brigle KE，Sierra EE，et al.Distinguishing between folate receptor-alpha-mediated transport and reduced folate carriermediated transport in L 1210 leukemia cells.J Biol Chem，1995，270(14):7842-7849.

［2］Kamen BA，Smith AK.A review of folate receptor alpha cycling and 5-methylterahydrofolate accumulation with an emphasis on cell models in vitro.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(8):1085-1097.

［3］Shia J，Klimstra DS，Nitzkorski JR，et al.Immunohistochemical expression of folate receptor alpha in colorectal carcinoma:patterns and biological significance.Hum Pathol，2008，9(4):498-505.

［4］Brown JM，Neuper C，Clayton A，et al.Rationale for folate receptor alpha targeted therapy in“high risk”endometrial carcinomas.Int J Cancer，2008，123(7):1699-1703.

［5］Konda SD，Wang S，Brechbiel M，et al.Biodistribution of a 153 Gd-folate dendrimer，generation=4，in mice with folate-receptor positive and negative ovarian tumor xenografts.Invest Radiol，2002，37(4):199-204.

［6］Iwakiri S，Sonobe M，Nagai S，et al.Expression status of folate receptor alpha is significantly correlated with prognosis in non-smallcell lung cancers.Ann Surg Oncol，2008，15(3):889-899.

［7］Allard JE，Risinger JL，Morrison C，et al.Overexpression of folate binding protein is associated with shortened progression-free survival in uterine adenocarcinomas.Gynecol Oncol，2007，107(1):52-57.