氟维司群对乳腺癌细胞迁移及局部黏着斑激酶的影响

刘晓红李铮朱筑霞李阳王红梅朱翠萍王旭东

1.贵阳医学院生理学教研室，贵州 贵阳 550004；

2.贵阳医学院校医院，贵州 贵阳 550004

氟维司群对乳腺癌细胞迁移及局部黏着斑激酶的影响

刘晓红1李铮1朱筑霞1李阳1王红梅1朱翠萍2王旭东1

1.贵阳医学院生理学教研室，贵州 贵阳 550004；

2.贵阳医学院校医院，贵州 贵阳 550004

背景与目的：雌激素(estrogen，E2)受体(estrogen receptor，ER)拮抗剂氟维司群(fulvestrant或ICI 182780，ICI)是治疗绝经后妇女乳腺癌的新型药物，而局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)与乳腺癌转移密切相关。本研究通过观察E2和ICI单独或联合作用对ER阳性乳腺癌细胞迁移及FAK表达的影响，探讨ICI对肿瘤细胞迁移的作用及其与FAK的关系。方法：采用ER阳性MCF-7乳腺癌细胞为研究模型，以E2(包括酒精，EtOH)和ICI单独或联合刺激细胞，采用蛋白质印迹法(Western blot)检测蛋白表达及相对分子质量变化，伤口愈合实验检测细胞迁移变化。结果：E2(10 nmol/L)和EtOH(0.3%)组均可明显刺激MCF-7细胞迁移(与DMSO组比较，分别增加51.5%和53.6%，P＜0.01)，但E2＋EtOH组对细胞迁移并无协同作用(与DMSO组比较，增加45.0%)。以ICI(10 μmol/L)预处理细胞后再给予E2处理，与对照组比较，细胞迁移增加了(38.9±4.9)%(P＜0.01)，与E2组比较减少了(8.32±3.21)%(P＜0.05)；ICI单独作用可明显促进细胞迁移(与DMSO组比较，增加19.1%，P＜0.01)。对照组细胞FAK主要为125×103和110×103两种形式，E2刺激可诱导FAK(125×103)呈现时间依赖性蛋白剪切，生成相对分子质量为35×103～70×103的小分子片段，而ICI预处理可有效阻断E2诱导的p125FAK蛋白剪切反应。结论：ICI单独作用可明显刺激MCF-7乳腺癌细胞迁移，但ICI对E2诱导的MCF-7细胞迁移具有抑制作用，该抑制效应可能与ICI阻断FAK蛋白剪切有关。

氟维司群；细胞迁移；局部黏着斑激酶；雌激素；乳腺癌

［Key words］Fulvestrant; Cell migration; Focal adhesion kinase; Estrogen; Breast cancer

氟维司群(fulvestrant或ICI 182780，ICI)是一种新型雌激素受体(estrogen receptor，ER)拮抗剂，主要用于治疗绝经后妇女ER阳性转移性乳腺癌［1］，但ICI的疗效有限且会出现治疗失败［1-2］。局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)在乳腺癌组织表达上调并与肿瘤转移密切相关［3］。细胞迁移(migration)是肿瘤转移过程中的必要步骤，但关于ICI对乳腺癌细胞迁移的影响及其机制，目前尚未完全明了［4-5］。本研究以ER阳性乳腺癌细胞MCF-7为模型，采用蛋白质印迹法(Western blot)及伤口愈合实验等方法，探讨ICI对乳腺癌细胞迁移的影响及其与FAK的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系及试剂

人乳腺癌细胞系MCF-7购自中国科学院昆明细胞库。DMEM(含酚红或无酚红)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶及青霉素/链霉素购自HyClone公司。活性碳处理胎牛血清(charcoal-stripped FBS，CS-FBS)购自BioWest公司。

1.1.2 抗体及重要试剂

17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)、ICI182780购自Calbiochem公司、无水乙醇(ethanol，EtOH)购自Sigma公司，抗FAK单克隆抗体购自Millipore公司，抗GAPDH抗体购自Cell Signaling公司，羊抗小鼠IgG-HRP抗体购自博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

MCF-7细胞常规培养采用DMEM培养基(含10% FBS、1%青霉素及1%链霉素)，在37 ℃、潮湿环境及CO2体积分数为5%的条件下进行，待细胞满度达90%时进行传代培养。

1.2.2 细胞划痕实验

取对数生长期细胞制成细胞混悬液并计数，调整细胞密度为2×105～3×105个/mL，按每孔1 mL接种于12孔培养板中。加入含10%血清的DMEM培养液，放入培养箱使其贴壁，培养2 d后细胞覆盖率达90%，换成含2%CS-FBS的无酚红DMEM，24 h后形成单层细胞，用200 μL枪头作“十”字划痕，用无菌PBS洗涤3次，换含2%CS-FBS的无酚红DMEM，随机分为6组，分别加入0.1% DMSO、10 nmol/L E2、0.3% EtOH、E2+EtOH、10 μmol/L ICI、E2+ ICI处理，置于培养箱内培养24 h，在倒置显微镜下拍照。用Photoshop软件测量划痕距离，每孔随机取3个位点，测算细胞划痕部位“伤口”宽度，实验重复6次。24 h细胞迁移率=(DMSO组伤口宽度-处理组伤口宽度)/处理组伤口宽度×100%。

1.2.3 Western blot检测

细胞培养至50%～60%覆盖率后，换以无血清、无酚红DMEM继续培养24 h，以耗尽细胞内生性激素。将细胞分为4组：对照组(0.1% DMSO)、E2组(10 nmol/L E2)、ICI组(10 μmol/L)、E2 + ICI组(10 nmol/L E2 +10 μmol/L ICI)。分别于E2组处理0、1、6、12和24 h后，ICI组、E2+ ICI组处理24 h后，加入RIPA裂解液(碧云天公司)裂解细胞。取样品上清液留用，采用BCA法进行蛋白定量。每个泳道按30 μg蛋白质样品进行上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后将分离蛋白电转移至PVDF (Millipore公司)；5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，按要求加入相应抗体室温杂交1～2 h，4 ℃温育过夜；然后以TBST洗膜后加入相应辣根过氧化物酶标记二抗(1∶2 000)室温杂交1 h，PVDF膜以化学发光试剂盒(Millipore公司)进行显色。采用自动凝胶成像系统(Syngene公司)进行成像，GeneSnap软件分析蛋白印迹结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件对实验数据进行统计学处理和分析。数据以表示，细胞划痕实验结果分析用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 E2和具有E2活性的EtOH对MCF-7细胞迁移的影响

以E2(10 nmol/L)、EtOH(0.3%)分别处理MCF-7细胞，发现两组均可显著刺激细胞迁移，与对照组比较，迁移率分别增加(51.5±4.5)%和(53.6±5.1)%(P＜0.01)，但E2＋EtOH组细胞迁移率增加(45.0±3.6)%，无协同效应(图1)。

2.2 ICI单独或与E2联合使用对MCF-7细胞迁移的影响

以ICI(10 μmol/L)预处理MCF-7细胞，发现ICI对E2(10 nmol/L)诱导的细胞迁移有明显的抑制作用，与对照组比较增加了(38.9±4.9)%(P＜0.01，图2)，与E2组比较减少了(8.32±3.21)%(P＜0.05，图2)。但ICI单独处理细胞，可见ICI能刺激细胞迁移，与DMSO组比较，迁移率增加了(19.1±3.1)%(P＜0.01，图2)。

图 1 伤口愈合实验结果显示E2和EtOH对MCF-7细胞迁移的影响Fig. 1 Wound healing analysis of the effects of E2 and EtOH on migration of MCF-7 cells

图 2 伤口愈合实验结果显示E2和ICI单独或联合作用对MCF-7细胞迁移的影响Fig. 2 Wound healing analysis of the effects of E2 and ICI on the migration of MCF-7 cells

2.3 E2诱导FAK蛋白表达和剪切及ICI的影响

以E2(10 nmol/L)刺激MCF-7细胞，可见FAK蛋白表达呈时间依赖性(0～24 h)增加，且发生蛋白剪切，生成相对分子质量在35×103～70×103之间的小片段(图3A)；ICI(10 μmol/L)可阻断E2诱导的FAK蛋白剪切35×103～70×103片段，但ICI单独处理对FAK蛋白无明显影响(图3B)。

图 3 Western blot结果显示E2诱导 FAK表达变化(A)及ICI的抑制效应(B)Fig. 3 Western blot analysis of the effect of E2 on FAK expression and its inhibition by ICI

3 讨 论

雌激素活性与乳腺癌关系密切，研究显示，E2和具有雌激素样活性的EtOH均可促进乳腺癌恶性演进［6-9］，如E2可通过促进乳腺癌细胞增殖、迁移和浸润［6-7］。本研究通过离体实验发现，E2和EtOH均可明显刺激MCF-7细胞迁移，但未见协同效应，结果支持酒精与乳腺癌有关的文献报道［8］，提示雌激素活性与乳腺癌发展存在相关性。内分泌疗法是治疗乳腺癌的重要措施之一，具有不会引起化疗常见的不良反应的优点。目前主要采用芳香化酶抑制剂以降低体内E2水平或拮抗ER以减弱或阻断E2信号通路，从而达到延缓肿瘤发展、提高患者存活率和生活质量的目的。ICI可用于治疗绝经后妇女的他莫昔芬耐受性乳腺癌，其疗效不亚于芳香酶抑制剂。

一般认为，抗雌激素制剂他莫昔芬对子宫内膜细胞具有刺激作用，而作为纯ER拮抗剂的ICI无雌激素样作用。实际上，ICI对乳腺细胞是否具有刺激作用(如促进细胞迁移)目前还存在争议［4-5］。本研究显示，ICI对E2诱导的MCF-7细胞迁移具有一定的抑制作用，然而ICI单独使用可明显促进细胞迁移。同时发现，E2诱导的细胞迁移伴随FAK上调和蛋白剪切，而ICI可抑制E2诱导细胞迁移及伴随的FAK蛋白剪切，这可能是ICI阻断ER的结果，而ICI单独作用促进MCF-7细胞迁移的机制可能与兴奋G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30，GPR 30)有关［4］。结果提示，当ER信号通路被阻断后，乳腺癌细胞还可通过非ER(如GPR30)通路保持对E2刺激的反应性(如细胞迁移)。

FAK是一种胞内酪氨酸激酶，在肿瘤向恶性侵袭表型演进的过程中起着重要的作用。FAK的蛋白剪切可改变其激酶活性，影响细胞局部黏着动力学过程及细胞迁移［10］。研究显示，FAK激酶活性受到其氨基端(N-terminus)结构域的自身抑制作用［10-11］，使野生型FAK酶活性受到天然抑制。本研究组新近资料显示，E2诱导的FAK蛋白剪切与细胞内钙激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP)活化有关［6］，而CANP对FAK的蛋白剪切点位于FAK的N端［12］，因此有利于FAK的激活。本研究发现，ICI可显著抑制E2诱导MCF-7细胞FAK蛋白剪切及细胞迁移，提示FAK变化可能与E2刺激细胞迁移有关［13］。然而，以ICI单独刺激也可促进MCF-7细胞迁移，但不影响FAK，可见E2及ICI促进细胞迁移的机制可能有所不同。本研究结果还提示，在乳腺癌内分泌治疗方面，应考虑同时阻断ER和非ER信号通路的联合治疗方案以获得理想疗效。

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《抗癌》杂志征稿启事

《抗癌》杂志于1988年创刊，主管单位为上海市科学技术协会，主办单位为上海市抗癌协会，杂志刊号：CN31-1664/R ISSN 1008-3065。征稿栏目及内容如下。

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邮 编：200032 电 话：021-64043766

传 真：021-64043766 E-mail：anti-cancer@163.com

Effects of fulvestrant on the migration and focal adhesion kinase in breast cancer cells

LIU Xiaohong1, LI Zheng1, ZHU Zhu-xia1, LI Yang1, WANG Hong-mei1, ZHU Cui-ping2, WANG Xu-dong1(1. Department of Physiology, Guiyang Medical University, Guiyang Guizhou 550004, China; 2. Campus Hospital, Guiyang Medical University, Guiyang Guizhou 550004, China)

WANG Xu-dong E-mail: xdwang@gmc.edu.cn

Background and purpose：Fulvestrant (ICI182780, ICI) is a novel anti-estrogen drug for treatment of metastatic breast cancer, and focal adhesion kinase (FAK) is strongly involved in metastasis of breast cancer. This study was performed to investigate the impact of ICI on the estrogen (E2)-induced cell migration and its association with expression of FAK in estrogen receptor (ER)-positive breast cancer cells. Methods：ER-positive MCF-7 breast cancer cells were employed as a model system. E2, ethanol (EtOH) or ICI was used alone or in combination to treat model cells. Western blot was applied to analyze protein expression and wound healing assay to assess cell migration. Results：Both E2 and EtOH stimulated significant migration of MCF-7 cells, but no cooperative effect was observed. Importantly, ICI had significant inhibitory effect on E2-induced migration, while ICI, when used alone, also enhanced cell migration. When cells were not insulted, FAK was primarily expressed in the forms of 125×103and 110×103, and E2 treatment triggered cleavage of FAK (p125) into low molecular isoforms. E2 treatment produced time-dependent proteolysis of FAK and this effect was blocked by pretreatment with ICI. Conclusion：ICI stimulates cell migration in MCF-7 cells when used alone, while it inhibits E2-enhanced migration possibly by blocking proteolysis of FAK.

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.004

R737.9

：A

：1007-3639(2013)03-0179-05

2012-10-25

2012-12-20）

国家自然科学基金(No：30860093)；贵州省优秀人才省长专项基金[No：黔省专合字(2008)56号]。

王旭东 E-mail:xdwang@gmc.edu.cn