食疗对寒热体质大鼠基因表达作用的研究*

张伟妃，张瑞义，李福凤，张伟荣

(上海中医药大学，上海 201203)

体质是人群及人群中的个体在遗传的基础上，在环境的影响下，在其生长、发育和衰老的过程中形成的机能、结构与代谢上相对稳定的特殊状态[1]。大量研究表明，体质是可变的[2，3]。食疗即饮食疗养，是利用不同的食物来影响整个机体的功能，使其获得健康或治愈疾病的一种手段或措施[4]。我们前期的研究表明，寒、热体大鼠在肝细胞腺苷酸激酶(ADK)活性和细胞能荷、脾淋巴细胞增殖指数(SLPI)、外周淋巴细胞 DNA的复制合成指数(PLDRI)等指标上均有差异[5，6]，且上述指标通过不同性味的食物作用后出现改变[7，8]。同时，我们还率先应用基因芯片技术对寒热体大鼠的基因表达进行研究，共筛选出寒、热体质大鼠肝脏中有显著差异表达的基因31条，其中表达上调的基因26条，表达下调的基因5条，并有特征性基因2条，即Atp6nl(H+-ATP酶)、Ins2(胰岛素2)。较有代表性的差异基因为AChE和Txnrd1[9]。本文即在此基础上用不同性味的食物对上述基因表达的调节作用进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

Wistar雄性大鼠100只，体质量100±10g，由上海中医药大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(沪)2008-0016)。实验条件:动物饲养在上海中医药大学实验动物中心，恒温20±2℃，自动光-暗控制(LD12∶12 ，即 07∶00-19∶00 光照，19∶00-07∶00暗置)，相对湿度60% ～65%，动物摄食饮水自由。实验前适应环境饲养1周。通过WMY-01型数字温度计(精确度为0.01℃)测定法[5]，筛选出常体6只、寒体12只、热体12只，并将寒体、热体随机分为2组进行食疗。即将大鼠分为常体组、寒体组、寒体调整组、热体组、热体调整组，每组6只。

1.2 食疗配方及方法

寒性食疗饲料由百合、莲子、绿豆和基础饲料按1∶1∶1∶5的比例来制作;热性食疗饲料每 15g饲料里含0.5g五香粉，保证每只大鼠每天摄取五香粉不少于0.5g[8]。常体组、寒体组和热体组喂饲普通饲料，寒体调整组喂饲热性饲料，热体调整组喂饲寒性饲料，时间为90d。

1.3 实验方法

在实验过程中观察食疗前后大鼠掌温变化，于调整结束时分别取上述5组大鼠肝脏右叶肥厚部位，提取组织总 RNA，进行 TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术对前期实验筛选出的特异性基因Atp6n1和差异性基因 AChE和 Txnrd1[9]进行相对浓度检测。引物及探针均由上海生物工程技术有限公司合成，引物探针序列使用Primer Express 3.0设计。

1.4 统计学方法

数据使用REST 2005相对定量数据分析软件进行分析。软件分析后的数据用均数±标准差(s)表示，采用SPSS 13.0版软件进行齐性检验并t检验和方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 食疗前和食疗后大鼠掌温变化

表1 食疗前和食疗后大鼠掌温变化表(s，℃)

表1 食疗前和食疗后大鼠掌温变化表(s，℃)

注:与常体组比较:＊＊P＜0.01;与寒体组比较:※P＜0.05，※※P＜0.01;与寒体调整组比较:▲▲P＜0.01;与热体组比较:●●P＜0.01

组个月常 体 组 6 27.24±0.29 27.14±0.45 26.17±0.56 26.64±0.别 例数 食疗前 食疗半个月 食疗1个月 食疗2个月 食疗3 26.12±0.61 27.07±0.59 27.49±0.41 77 27.77±0.55寒 体 组 6 26.56±0.26＊＊ 26.83±0.33 25.76±0.38 26.65±0.50 27.45±0.51寒 体 调 整 组 6 26.62±0.12＊＊ 27.14±0.41 26.12±0.29 27.28±0.74 27.97±0.81热 体 组 6 27.63±0.20＊＊※※▲▲ 27.34±0.54※ 26.38±0.31※ 27.34±1.63 27.92±1.15热 体 调 整 组 6 27.77±0.21＊＊※※▲▲ 26.48±0.18＊＊▲▲●●

寒热性味食物对大鼠掌温有影响。食疗半个月后，寒体调整组掌温升高，且与常体组差异无统计学意义，热体调整组与热体组比较差异有统计学意义意义(P＜0.01)。食疗1个月后，寒体调整组与热体调整组均与常体组差异无统计学意义(P＞0.05)。食疗2个月、3个月时，各组差异已均无统计学意义(P＞0.05)。在不同阶段观察常体组、寒体组和热体组均有波动，但波动方向均一致，可能是由于在大鼠生长的不同阶段测量且受外界环境影响所致。

2.2 食疗后 Atp6n1、AChE和 Txnrd1基因表达量的比较分析

表2 食疗后Atp6n1、AChE和 Txnrd1基因表达量比较分析表(x ± s，℃)

通过实时荧光定量PCR验证得出，食疗3个月后，寒体调整组 Atp6n1、AChE表达量降低不明显，仍与常体组差异有显著统计学意义(P＜0.01)，Txnrd1有上升趋势，且与常体组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。热体调整组Atp6n1上升明显，与各组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，AChE、Txnrd1均有上调趋势，与热体组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。与常体组和热体组比较，寒体组Atp6n1、AChE表达仍上调，Txnrd1下调，与前期实验结果一致[10]，且实验指标的变化趋势与大鼠掌温变化基本相一致，说明不同性味的食物确实能引起寒热体大鼠基因表达水平上的变化。

3 讨论

大鼠自然群体中存在寒热体质差异，并可通过测定大鼠后脚掌掌温来筛选出寒体、热体及常体体质大鼠。与人为造模方法相比，自然体质筛选法有不破坏动物自身机能状态的优越性，符合中医的整体观。体质的稳定是相对的，具有一定的可调性，根据体质的特点以及食疗学的理论，恰当地选择相应的食物以调整病理性体质和防治疾病是临床实践的迫切需要[11]。本实验取大辛大热之五香粉，寒凉之品百合、莲子、绿豆对前期实验筛选出的寒热体质大鼠进行调整并对特征性基因Atp6nl(H+-ATP酶)和较有代表性的差异基因AChE及Txnrd1进行研究。H +-ATP 酶 (ATPase， H + transporting，lysosomal V0 subunit a isoform 1，Atp6nl)是 ATP 酶的1种，主要作用是水解ATP，产生的能量用于将细胞浆中的 H+泵入溶酶体中[12]。乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)又称真性胆碱酯酶，是生物神经传导中的一种关键性的酶，主要存在于胆碱能神经末梢突触间隙，该酶能降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递[13]。硫氧还蛋白还原酶 1(thioredoxin reductase 1，Txnrd1)是硫氧还蛋白还原酶的一种，Txnrd1和其底物硫氧还蛋白1(Trx1)组成了一个氧化还原系统，Txnrd1促进了 Trxl的还原，调节氧化应激。低表达的Txnrd1，导致氧化还原反应减少，使各种氧化物堆积，降低了能量利用率。本次实验结果发现，食疗3个月后，寒体调整组Txnrd1表达上调，与常体组比较已无统计学意义;Atp6nl、AChE在热体调整组中表达显著上升，可能寒凉之品的食疗方对热体大鼠的体质影响明显，体质已有所调整，引起基因表达水平的变化。食疗调整后，寒体调整组和热体调整组在基因表达水平上均有所变化，但寒体调整组变化不及热体调整组变化明显，可能是由于样本量不足(每组6只)，或是食疗调节时间不足引起，亦有可能寒体体质本身不敏感，调节时间需要比热体组调整时间长。热体调整组Txnrd1表达反而上升明显，几乎是热体组的2倍，且已超过常体的表达量，其机制有待进一步探讨。

本实验结果表明，不同性味的食物对寒体和热体大鼠在基因表达水平上均有显著的调整作用，为临床上通过食物调节特异性基因表达水平来改善体质提供了实验依据，也为中医的食疗学说提供了分子生物学的实验依据。

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