胶质芽孢杆菌液体发酵产孢条件的优化

王金玲，张洪超，2，赵凤艳，吕长山

(1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040;2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122;3.东北农业大学应用技术学院，黑龙江哈尔滨 150030)

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginous)又名胶冻样芽孢杆菌，国内通常称之为硅酸盐细菌［1－2］。农业上，胶质芽孢杆菌具有解钾、溶磷作用以及易形成根系优势种特性［3－5］，是目前我国微生物肥料产品中较为重要的一种。工业方面，胶质芽孢杆菌在无氮培养基或较大的C/N培养基中易产生显著的胞外多糖荚膜，利用这种多糖的絮凝作用生产优势明显的微生物絮凝剂前景广阔［6－7］。冶金工业上，胶质芽孢杆菌可应用于细菌淋滤和改进某些矿物材料的特性［8］，尤其对低品位矿物的开发以及回收利用某些有用金属具有良好的前景。养殖业方面，胶质芽孢杆菌生长过程产生的蛋白质、有机酸等，可用作饲料补充物，提高饲料的价值［9］。因此提高胶质芽孢杆菌的活菌或芽孢数量与质量具有重要的现实应用意义。本实验在优化的培养基基础上，通过单因素实验和正交实验，考察了发酵培养条件对产孢量的影响，以期为胶质芽孢杆菌的广泛应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginous) 购自中国普通微生物菌种中心，CGMCC1.0910，经紫外诱变处理，本实验室保存;乳糖、蔗糖、硫酸铵、硫酸锰、磷酸氢二钠、碳酸钙、氯化铁、盐酸、氢氧化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾 天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯;蛋白胨、琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司，生物试剂。

SYQ－DSX－280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;ZD－85恒温振荡器 常州国华电器有限公司;HZQ－X100振荡培养箱 哈尔滨市东明医疗仪器厂;DH－6000A电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;XW－80A旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;XB－K－25血细胞计数板 上海求精生化试剂仪器有限公司;XSZ－4G双目显微镜 北京联合科仪科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 斜面培养基:亚历氏硅酸盐细菌培养基，蔗糖5g;磷酸氢二钠2g;七水硫酸镁0.5g;氯化铁0.005g;碳酸钙0.1g;土壤矿物，取耕层土加入20%盐酸(耕层土∶盐酸 =1∶10)煮沸30min，蒸馏水洗至无氯离子，过100 目筛［10］，1.0g;琼脂30g;蒸馏水1000mL;pH7.0～7.2。

种子培养基:蔗糖10g;磷酸氢二钾0.5g;七水硫酸镁0.5g;碳酸钙1g;蒸馏水1000mL;pH7.5。

发酵培养基:乳糖21.57g;复合氮源2.6g;硫酸锰0.21g;磷酸氢二钾1.5g;七水硫酸镁1.2g;蒸馏水1000mL;pH7.5。其中，复合氮源质量比为硫酸铵∶蛋白胨 =3∶1。

1.2.2 培养方法 菌种活化:将保存的菌种转接至斜面培养基，32℃活化24h。

种子摇瓶培养:用接种环挑取3环菌泥，接入装有种子培养基 35mL的 250mL三角瓶中，32℃、200r/min摇瓶培养20h。

摇瓶发酵培养:将种子培养液接入发酵培养基中，接种量为5%，发酵培养基装液量为50mL/250mL，32℃，200r/min振荡培养24h，然后变温培养16h。

1.2.3 芽孢计数法 实验过程中因素与组合的优劣比较采用血球计数板计数法［11］，计数前将菌液在80℃水浴槽中热处理15min。

1.2.4 单因素实验 培养条件中分别考察接种量、装液量、发酵后期温度、碳酸钙用量、摇床转速对实验结果的影响，每个因素选取7个水平，每实验3次重复，实验设计见表1。

表1 单因素实验因素水平编码表Table1 Coding list of factors and levels in single factor experiments

1.2.5 正交实验 根据单因素实验结果，选择影响较大的4个因素，确定各因素的中心水平并进行正交实验，因素及水平见表2。

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1.2.6 验证实验 在优化所得的最佳培养条件下做菌体生长曲线，进行验证并获得最佳培养时间，验证实验3次重复。

1.3 数据处理方法

实验中图表绘制采用Microsoft Excel处理;正交实验设计与方差分析应用软件为正交设计助手Ⅱv3.1。

表2 正交实验因素及水平表Table2 Factors and levels in orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 接种量对发酵结果的影响 胶质芽孢杆菌最佳接种量实验结果见图1。

由图1可知，接种量从1%增加到7%时，芽孢产量呈现上升趋势，之后随接种量的继续增大，芽孢产量反而下降。接种量增加，菌体会快速生长并形成芽孢，但接种量超出一定范围时，由于微生物之间竞争生存空间与培养基的营养成分，同时产生过多的代谢废物，从而影响芽孢的进一步转化，因此实验中选择7%的接种量为进一步优化实验的中心水平。

图1 接种量对芽孢产量的影响Fig.1 Effect of inoculated amounts on spore yield

2.1.2 后期温度对发酵结果的影响 发酵工艺参数的优化实验中，菌体生长与芽孢转化选用不同的培养温度。根据对胶质芽孢杆菌培养过程中芽孢产量的定期检测，发酵的前24h采用较低的32℃，之后的温度分别提升至34～40℃，水平间隔为1℃，实验结果如图2所示。

由图2可知，胶质芽孢杆菌发酵过程中适宜于芽孢形成的温度集中于36～37℃。温度升高，微生物新陈代谢原有的平衡被打乱，引发相关酶的活性变化，微生物生长受到影响;当温度高于37℃时，随温度的继续升高，胶质芽孢杆菌发酵所得芽孢量呈现下降趋势;选择曲线峰值点即发酵后期温度37℃为后续优化实验的中心值。

2.1.3 碳酸钙对发酵结果的影响 胶质芽孢杆菌发酵过程中的pH呈现动态变化，当pH低于6.5和高于8.5均对菌体的增殖不利;有研究证实［12］，如果对数生长后期发酵液的pH不能回升至6，则芽孢与伴孢晶体无法形成，因此控制发酵液pH对发酵过程中芽孢的形成与产量具有较大的影响。

胶质芽孢杆菌发酵最适起始pH为7.5，发酵过程中通过碳酸钙调节发酵液pH，促进芽孢合成，结果见图3。

图2 温度对芽孢产量的影响Fig.2 Effect of different temperatures on spore yield

图3 碳酸钙用量对芽孢产量的影响Fig.3 Effect of calcium carbonate amounts on spore yield

2.1.4 装液量对发酵结果的影响 装液量与胶质芽孢杆菌发酵过程中的营养物质供给和溶氧量紧密相关，实验中选取30～90mL的装液量进行考察，血球计数板计数法结果如图4所示。

图4 装液量对芽孢产量的影响Fig.4 Effect of broth volumes on spore yield

由图4可见，随着装液量的增加，芽孢产量呈现先增加后降低的趋势，后期下降趋于缓慢;这是由于装液量在增加营养物质与溶氧量的同时会导致菌体间的激烈竞争，致使容器内代谢废物大量积累，当超过一定量时，这种反面作用更为突出，以致于对产孢形成抑制作用。实验中选择峰值出现时的装液量60mL为中心水平。

2.1.5 摇床转速对发酵结果的影响 发酵过程中调节转速主要是作为发酵液中溶氧量的调节手段。胶质芽孢杆菌为好氧性细菌，增大溶氧量有利于菌体的增长。实验中选取了100～250r/min 7个转速水平，间隔为25r/min，实验结果见图5。

由图5可见，在100～200r/min转速范围内，随转速的增加芽孢量明显增加;在200～250r/min转速范围内，芽孢产量增加趋势变缓，但明显高于低转速范围的产孢量。结果表明，转速增加有利于芽孢的形成，但转速继续增加会因摩擦作用对菌体与芽孢产生机械破坏作用，实际摇床培养条件也较少高于250r/min，因此实验优选转速固定为250r/min。

图5 摇床转速对芽孢产量的影响Fig.5 Effect of rotate speed on spore yield

2.2 正交实验

根据单因素实验结果，摇床转速固定于250r/min，其他因素以单因素最佳值为中心进行适当扩大，进行正交实验，因素及水平的设计见表2，实验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 正交实验结果Table3 Results of the orthogonal experiment

由表3可知，影响芽孢产量的因素顺序是:接种量＞碳酸钙用量＞装液量＞温度;其中碳酸钙用于调节发酵过程中的pH，实验结果表明碳酸钙用量与接种量这两个因素对发酵效果影响较为显著。胶质芽孢杆菌发酵的最佳工艺参数组合为A3B2C1D3，即装液量为70mL/250mL，发酵后期温度为37℃，接种量为5%，碳酸钙用量为6g/1000mL。

由表4方差分析可以看出，接种量和碳酸钙用量对芽孢产量的影响显著，其他两项的影响不显著，此结果与正交实验结果的极差分析结论一致。

表4 正交实验结果方差分析Table4 Variance analysis of the results

2.3 生长曲线验证实验

以上述实验所得的最佳培养条件进行发酵，以血球计数板计数芽孢数，做胶质芽孢杆菌的生长曲线如图6所示。经验证，培养36h芽孢数量最大，血球计数板计数显示芽孢数量为9.3×109cfu/mL，培养40h芽孢数量为8.7×109cfu/mL，所得结果与正交实验结果相符。

图6 胶质芽孢杆菌的生长曲线Fig.6 Growth curve of Bacillus mucilaginosus

3 讨论

目前关于胶质芽孢杆菌发酵的研究主要集中于提高产菌量［14］与抑制胞外多糖［15］的产生方面。不同的胶质芽孢杆菌菌株在液体发酵培养下产生的活菌数或者芽孢数量存在较大差异。与提高产菌量相比，在提高芽孢产量方面，复合氮源的筛选与搭配、发酵后期温度与通氧量的调整［11］、发酵过程中pH的调整也有少量的研究［16］。吴向华和刘五星［17］对一株自行筛选的胶质芽孢杆菌的培养条件研究结果显示，培养基起始 pH7.5，培养温度 36℃，装液量30mL/250mL锥形瓶;在此基础上利用70L发酵罐进行发酵，培养周期33h，芽孢量可以达到9.58×108cfu/mL;此结果与胡秀芳等人［16］的研究结果相似，后者对一株离子束诱变的胶质芽孢杆菌进行了培养条件研究，结果表明，发酵培养基的理想配方为:2%淀粉、0.4% 酵母、0.1%K2HPO4、0.1%MgSO4·7H2O、0.5%CaCO3，pH7.5;种子菌经二级扩大培养后，按6%的接种量接入70 L发酵罐，在32℃进行发酵，通氧量2.0～2.5vvm，培养周期38～42h，芽孢量可达到9.8 ×108cfu/mL。陈育如等［18］的研究结果显示胶质芽孢杆菌最佳的培养条件为，pH7、温度36℃、转速220r/min、装液量50mL，细菌菌量可达10.6×108个/mL。本研究中，采用加入碳酸钙控制发酵pH，以利于芽孢形成，同时采用变温培养的方法，结果表明，培养36h芽孢数最大，血球计数板计数显示芽孢数量为9.3×109cfu/mL，显著高于其他研究者，这可能与本菌株经过紫外诱变处理有一定关系，采用血球计数板计数与其他方法的不同也会产生影响。

本实验中得到的发酵培养基与发酵培养条件，可以为工农业生产胶质芽孢杆菌提供一定参考，但是要应用到工农业生产，还需要进一步研究放大实验效果，筛选通氧量，搅拌转速等条件。

4 结论

胶质芽孢杆菌优化后的发酵工艺参数为:接种量5%，起始pH7.5，碳酸钙用量6g/1000mL，装液量70mL/250mL三角瓶，转速250r/min，发酵前24h温度为32℃，之后12h温度37℃，最佳培养时间36h，所得芽孢数量为9.3×109cfu/mL。实验结果为胶质芽孢杆菌工农业生产提供了数据参考。

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