白腐菌发酵培养及诱导剂对漆酶合成的影响

李 鑫，李建科，董 攀，邓文辉

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西南昌 330047)

漆酶(Laccasc，EC1.10.3.2.)，是一种含铜的多酚氧化酶，1883年首次从日本漆树的汁液中发现［1］，随后人们研究发现它广泛存在于植物［2］、昆虫［3］和高等真菌中［4］。漆酶可以催化氧化酚类化合物，脱去羟基上的电子或质子，形成自由基，导致酚类及木素类化合物降解，同时使分子氧被还原为水［5］，由于它催化性能特殊，作用底物广泛，引起人们越来越浓厚的兴趣，成为生物、化学和环境领域的研究热点。漆酶最突出的功能是降解纸浆中的木质素、漂白废水、去除废水中的有毒酚类物质，在造纸行业中具有非常大的应用前景。目前，国内外对漆酶的研究有两个方向，一个是寻找合适的载体进行漆酶基因的异源表达，但白腐真菌在活性宿主的高效表达较为困难，使其仍然处于探索阶段［6－8］;所以对漆酶的研究主要集中在菌种筛选、培养条件优化、酶的固定化和对污染物的处理等方面［9］。真菌漆酶的合成水平与菌株本身的产酶能力密切相关，同时还受到环境条件的影响，如碳源、氮源、诱导剂等多种因素［10－13］，诱导剂添加与否、添加量及添加时间对漆酶酶活的影响十分显著［14］。本实验在液体培养的条件下，研究各种因素对贝壳状革耳菌P.conchatus合成漆酶能力的影响，找出最适合产酶的条件，最大程度的提高漆酶酶活［15－16］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

贝壳状革耳菌Panus conchatus 由华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室提供;葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏 天津市冠前华工经销部;五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)、硫酸铵、苯酚、苯甲酸、尿素 国药集团化学试剂有限公司，分析纯;2，2－联氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二铵盐(ABTS)、愈创木酚 Sigma公司;豆粉 安阳市奇天生物技术有限公司;麦麸、稻草 购于当地市场。

LRH－250生化培养箱 上海恒一科技有限公司;LS－C50型立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备厂;SW－CJ－1FD单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;UV－7504紫外可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司;PY150－2/2摇床 武汉汇诚生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基组成及培养条件 液体种子培养基:土豆汁30%，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然，玻璃珠2颗。在制作种子培养基时，往摇瓶中加2颗玻璃珠，振荡培养时，由于有玻璃珠的存在，菌丝不会长成大颗粒的菌丝球，而是形成浑浊均一的细丝状液体，用移液枪直接吸取定量的菌丝液即可。产酶发酵培养基:土豆汁30%，葡萄糖20g/L，蛋白胨1g/L，MgSO43g/L，KH2PO43g/L，pH自然。培养条件:在250mL三角瓶中，装液量50mL，接种量10mL，培养温度30℃，转速150r/min，振荡培养12d。

1.2.2 培养基优化 碳源筛选:只改变产酶培养基中的碳源种类，浓度均为20g/L，其他条件不变，找出最适合产漆酶的碳源;氮源筛选:只改变产酶培养基中的氮源种类，浓度均为1g/L，其他条件不变，找出最适合产漆酶的氮源;最适C/N:筛选出最适的碳源氮源后，固定碳源浓度为20g/L，改变氮源的含量，使得 C/N 比分别为 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。

1.2.3 诱导剂的筛选 在优化后的初始培养基中添加诱导剂，选择麦麸、稻草、Cu2+、ABTS、愈创木酚、苯酚、苯甲酸几种物质作为诱导剂，初步筛选出有诱导效果的诱导剂，并做单因素实验，确定诱导剂的最佳添加量。

1.2.4 Cu2+添加时间及添加量 在初始培养基中首先添加麦麸，然后在不同的培养时间内，添加不同浓度Cu2+，找出Cu2+最适合的添加时间及添加量［14］。

1.2.5 分析测定方法

1.2.5.1 菌丝干重的测定方法 取出250mL的三角瓶中的发酵液，发酵液用8层纱布过滤后，转移至称量瓶，于100～105℃烘箱中烘至绝干，称重。

1.2.5.2 漆酶活力测定漆酶活力的测定 以ABTS为底物，酶液经适当稀释后，用等体积酶液和0.5mmol/L ABTS溶液反应，测定反应前3min内420nm处吸光值的增加量，定义每分钟使1μmol ABTS转化所需要的酶量为1个漆酶活力单位(U)［17］。

2 结果与分析

2.1 接种菌龄的确定

种子质量的优劣直接关系到发酵液中酶活的高低。菌体刚开始时生长缓慢;随着培养时间的增加，菌体吸收培养基中的营养物质，菌丝重量迅速增加，生命力旺盛;继续培养，营养物质消耗，代谢产物开始累积;之后菌体开始衰退。接种时间应选在菌体生命力旺盛的对数时期。如图1所示，为P.conchatus生长曲线。

从图1可以看出，菌体生长的对数期为第3～6d，在第5d菌丝干重急剧增长，此时菌体生命力最旺盛，之后便转入生长稳定期。因此确定菌体的接种种龄为5d。

图1 生长曲线Fig.1 Growth curve

2.2 培养基优化

2.2.1 碳源对漆酶合成的影响 真菌细胞干重的一半是由碳组成的［18］，碳源是菌体碳架的来源，并为菌体生长提供能量。考察五种不同的碳源［18－19］对P.conchatus合成漆酶的影响。

从图2可以看出，以葡萄糖为碳源的漆酶酶活最高，达到5693U·L－1。P.conchatus对碳源的利用率依次为葡萄糖＞蔗糖、麦芽糖＞可溶性淀粉、豆粉。葡萄糖是单糖，蔗糖和麦芽糖是二糖，可溶性淀粉和豆粉是多糖，说明P.conchatus更易利用分子量较小的碳源。

图2 碳源对漆酶合成的影响Fig.2 Effect of carbon source on laccase production

2.2.2 氮源对漆酶合成的影响 氮源对菌体合成蛋白质，核酸等含氮物质有重要作用，直接关系到后期的产酶。不同来源的氮对菌体生长的促进作用不同，考察五种氮源对白腐菌产酶的影响［18－19］。

从图3可以看出，以酵母膏为氮源的漆酶酶活最高，达到6023U·L－1。P.conchatus对氮源的利用率依次为酵母膏＞蛋白胨＞牛肉浸膏＞硫酸铵＞尿素。酵母膏是微生物来源的有机氮，蛋白胨和牛肉浸膏是动物来源的有机氮，硫酸铵和尿素是无机氮，总体来说，P.conchatus对有机氮的利用率比对无机氮的利用率高;在有机氮中，微生物来源的氮比动物来源的氮好。

2.2.3 C/N比对产酶的影响 以葡萄糖为碳源，酵母膏为氮源，确定葡萄糖的浓度为20g/L，改变酵母膏的含量，使得 C/N 比分别为 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1。

从图4可以看出，当C/N比为15时，P.conchatus合成漆酶的酶活最高，达到8795U·L－1。C/N比较小时，氮源充足，发酵液较粘稠，影响菌丝体对氧的吸收;C/N比较大时，碳源充足，对菌丝体生长有利，但不利于菌体产酶;只有当C/N比为15∶1时，菌丝体生长良好，且有利于漆酶分泌。

图3 氮源对漆酶合成的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on laccase production

图4 C/N比对漆酶合成的影响Fig.4 Effect of C/N on laccase production

2.3 诱导剂对白腐菌分泌漆酶的影响

漆酶是一种能够降解木质素的含铜的多酚氧化酶，在白腐菌产漆酶的过程中，加入一些与木质素有相似结构的化合物，能够诱导漆酶的合成。P.conchatus是一株表达效率较高白腐真菌，它在诱导剂的作用下，能合成高酶活的漆酶，比一般白腐菌合成漆酶的酶活高若干倍。因此选择合适的诱导剂及其用量，是漆酶优化工艺中非常重要的步骤。

2.3.1 诱导剂的筛选 微生物酶类分为组成酶和诱导酶。组成酶是指微生物无论在任何培养基中，总是适量地存在的一些酶类;诱导酶是依赖于酶作用底物或底物结构类似物的存在而合成的酶类。漆酶胞外组成酶产量较低，当添加与木质素或木质素衍生物相关的芳烃类和酚类，能显著提高漆酶酶活［17］。

根据参考的文献资料［20］，在优化后的初始培养基中添加诱导剂，选择麦麸、稻草、Cu2+、ABTS、愈创木酚、苯酚、苯甲酸几种物质作为诱导剂，初步筛选出有诱导效果的诱导剂。其中麦麸、稻草的含量为1%，Cu2+、ABTS、愈创木酚、苯酚、苯甲酸的浓度为1mmol/L，同时以不加诱导剂为空白做对比。

从图 5可以看出，麦麸、Cu2+和 ABTS对P.conchatus有显著的诱导效果，其中以Cu2+的效果最为突出，稻草、愈创木酚、苯酚、苯甲酸对P.conchatus的诱导效果不是很明显;而ABTS价格昂贵，所以选择麦麸和Cu2+作为该菌的诱导剂。

图5 诱导剂的筛选Fig.5 Inducers screening

2.3.2 诱导剂添加量单因素实验 麦麸可以作为木质素类似物，能够诱导漆酶的合成，同时，麦麸也作为碳源，为菌丝生长提供能量。通过麦麸添加量的单因素实验，找出麦麸的最适添加量。

从图6可以看出，当麦麸含量为1.5%时，漆酶酶活最高，达到24464U·L－1，漆酶酶活最高;麦麸含量过低，不足以诱导菌体产酶;麦麸含量过高，影响培养基中含氧量，菌体生长欠佳，不利于漆酶合成。

图6 麦麸的添加量对产酶的影响Fig.6 Effect of wheat bran addition on laccase production

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在培养过程中加入适当浓度的Cu2+，能诱导P.conchatus合成漆酶，显著提高漆酶酶活。

从图7可以看出，当Cu2+浓度为1mmol/L时，漆酶酶活最高，达到 40599U·L－1，在浓度为 0.5～2mmol/L时，对漆酶合成有促进作用;当Cu2+浓度为2mmol/L时，酶活为8903U·L－1，与不加诱导剂时的酶活8795U·L－1相当。过高浓度的Cu2+对菌体有毒性，使得微小的菌丝体难以存活，抑制菌体生长，不但没有促进，反而是抑制了漆酶的合成。此时，Cu2+对P.conchatus诱导合成漆酶的规律是，低浓度具有促进作用，高浓度具有抑制作用。

2.3.3 诱导剂组合实验 选择麦麸和Cu2+的最适添加量(1.5%麦麸与1mmol/L Cu2+搭配)，将两者同时添加到初始培养基中，作为组合诱导剂诱导P.conchatus合成漆酶。

从图8可以看出，将麦麸和Cu2+两种诱导剂进行组合，比单独使用一种诱导剂效果更好，两种诱导剂共同作用使酶活达到51004U·L－1。

2.3.4 Cu2+添加时间及添加量 根据2.3.2及2.3.3的实验结果，将麦麸和Cu2+两种诱导剂一起添加到培养基中，能显著提高Panus conchatus合成漆酶的能力，麦麸和Cu2+对Panus conchatus产酶有诱导效果，麦麸可以作为诱导剂添加到培养基中，又可作为培养基的碳源，对漆酶合成没有毒性，但Cu2+对菌丝体生长有毒性，在起始培养基中加入Cu2+时，菌丝体的生长过程受到抑制，微小的菌丝体对Cu2+毒性的耐受度差而死亡，最终使产酶仅由一些较大的菌丝体来完成，若Cu2+浓度超过一定界线，白腐菌合成漆酶的能力反而下降。因此设计实验，在初始培养基中首先添加麦麸，然后在不同的培养时间内，添加不同浓度 Cu2+，找出 Cu2+最适合的添加时间及添加量［14］。

图7 Cu2+浓度对产酶的影响Fig.7 Effect of Cu2+concentration on laccase production

图8 组合诱导剂对合成漆酶的影响Fig.8 Effect of inducers combination on laccase production

从图9可以看出，在发酵第4d，添加Cu2+使其浓度为3mmol/L，漆酶酶活能达到101968 U·L－1。从时间上分析，在第 4d添加 Cu2+酶活最高，此时P.conchatus处于对数期，菌丝体旺盛，生命力强，Cu2+毒性对菌丝体的影响最弱，Cu2+能充分发挥诱导作用;若在起始时添加Cu2+，虽然对漆酶合成有促进作用，但Cu2+的毒性会使一些生命力较弱的菌体死亡，使得发酵液酶活不是很高;在第2d添加Cu2+，菌丝体还处于生长延滞期，Cu2+同样会对菌丝体的生长产生毒性;在第6d添加Cu2+，此时的菌丝体已经即将进入稳定期，开始分泌漆酶，Cu2+的添加不会对菌丝体产生明显的毒性，但是诱导时期偏晚，最终酶活不够高。图7中，在初始培养基(即第0天)中添加1mmol/L Cu2+的酶活最高，为51004U·L－1;图9中改变Cu2+添加时间，Cu2+的最适添加量也随之改变，当Cu2+浓度为3mmol/L时酶活最高，为101968 U·L－1。由此可见，Cu2+不同的添加时间及添加量，对产漆酶酶活有很大影响。

图9 Cu2+添加时间及添加量对合成漆酶的影响Fig.9 Effect of Cu2+add quantity and add time on laccase production

3 结论

3.1 根据P.conchatus的生长曲线可知，该菌株的对数生长期为4～8d，其最适接种种龄为5d。

3.2 P.conchatus的最优碳源是葡萄糖，对碳源的利用顺序依次是单糖＞二糖＞多糖;最优氮源是酵母膏，对氮源的利用顺序依次是微生物来源氮＞动物来源氮＞无机氮;最适C/N比为15。

3.3 麦麸、Cu2+和ABTS对P.conchatus诱导作用比较明显;以麦麸为诱导剂，当含量为1.5%时，酶活达到27880U·L－1;以Cu2+为诱导剂，当浓度为1mmol/L时，酶活达到 40599 U·L－1;若将 1.5%麦麸与1mmol/L Cu2+搭配，比单独使用一种诱导剂的效果更好，能达到 51004U·L－1。

3.4 在发酵第4d添加3mmol/L Cu2+，漆酶酶活能达到101968U·L－1，比在初始培养基中添加1mmol/L Cu2+所达到的酶活高了将近两倍。

3.5 Cu2+对P.conchatus合成漆酶具有诱导性和毒性，若在培养初期加入Cu2+，其作用表现为低浓度促进，高浓度抑制;培养一段时间再加入Cu2+，菌丝体耐受力增强，Cu2+毒性减弱，能充分发挥诱导作用。

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