荧光法测定贝类邻苯二甲酸酯总量的条件优化

夏静芬，张仕榜，金婷婷，汪财生

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江宁波 315100)

邻苯二甲酸酯类(Phthalate esters，PAEs)又称酞酸酯，主要作为增塑剂被广泛应用于塑料工业中。但它与聚烯烃类塑料分子之间并不是以化学键结合，而是由氢键或范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质，因此，很容易从塑料中溶出和蒸发，从而转入空气、水体、底质和生物等环境载体中，且持久存在而不易分解。近年来的研究表明PAEs是一类环境激素类物质，可干扰人体激素的分泌，具有一般毒性和致畸、致突变性［1－2］。鉴于 PAEs毒性和普遍性，建立快速准确检测样品中PAEs含量的方法已成为研究的热点。目前，国内外测定PAEs的主要方法有气相色谱法［3－4］、气质联用法［5－6］、高效液相色谱法［7－8］以及表面增强拉曼光谱［9］等。荧光光谱法测定PAEs则少有报道，且多数工作集中在单因素优化方面［10－11］，而在 PAEs 的荧光反应过程中各因素往往是相互影响的。响应面法基于非线性模式进行设计和研究，将体系的响应作为多个因素的函数，并运用图形和建模技术将这种函数关系显示出来，具有精度高、预测性好等优点，已被广泛用于同时存在多因素影响的实验优化等方面，但在荧光法测定PAEs总量的优化研究方面还未见报道。贝类属于滤食性生物，移动性较差，生活方式固定，当水环境受到污染后，在滤食饵料时不可避免地从水中吸入邻苯二甲酸酯等有害物质。本文以螺蛳为研究对象，并通过响应面法对影响荧光法测定PAEs的因素水平及其交互作用进行优化与评价，这对于开展贝类生物体中PAEs安全检测工作具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

螺蛳样品 于2011年11月至12月购于宁波各大菜场;标准物质邻苯二甲酸二甲酯(DMP，99%)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP，99%)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP，99.5%)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP，98%)、邻苯二甲酸(2－乙基己基)酯(DEHP，99%)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP，99%) 均购自国药集团化学试剂有限公司;正己烷、二氯甲烷、甲醇 色谱纯;蒸馏水二次重蒸水;其他试剂 均为市售分析纯。

F－4500荧光分光光度计 日本日立公司;pHS23TC精密数显酸度计 上海天达仪器有限公司;KL512数控恒温水浴氮吹仪 北京康林科技有限责任公司;KS－1000T超声波清洗机 宁波海曙科生超声设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集及处理 将螺丝去壳后，准确称取5.0g左右螺丝肉，用生理盐水清洗，置于高速组织捣碎机中捣碎，并移入50mL不锈钢离心管中，于4℃，8000r/min条件下离心10min。弃清液，同法2次，滤渣加入8mL 1∶1的正己烷和二氯甲烷混合液，置于1000W的超声波清洗机中超声提取30min，而后在4℃，160r/min条件下摇床振荡1h。取出后，在4℃，8000r/min条件下离心10min，重复萃取三次。取上清液置于比色管中，经氮吹至干。加入2mL甲醇，在小型超声提取仪中超声溶解0.5h，经0.45μm有机滤膜过滤后待测。按上述操作步骤同时用蒸馏水制备空白样品。

1.2.2 单因素实验 分别以NaOH溶液浓度(1.0、2.5、5.0、7.5、10mol/L)，Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液 pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，5.7 ×10－3mol/L 的 EDTA－Fe(Ⅱ)(0.1、0.3、0.5、0.7、1mL)和 3% 的 H2O2(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL)用量为单因素，考查 4 个因素对荧光反应强度的影响。荧光法反应操作流程如下:取0.2mL的邻苯二甲酸酯工作液于20mL比色管中，加入0.5mL一定浓度的NaOH溶液，稀释至10mL，70℃水浴加热15min后取出，冷却至室温，加1∶1 HCl调至中性，依次加入7mL缓冲溶液，EDTA－Fe(Ⅱ)溶液，H2O2溶液，定容至20mL，室温反应2h(从加入EDTA－Fe(Ⅱ)溶液摇匀后计时)后，测定体系的荧光强度。同时以0.2mL的甲醇为空白对照。后续因素的实验将前一因素的较佳条件代入以置换初始条件。

1.2.3 响应面法优化荧光反应条件 在单因素实验的基础上，确定Box－behnken设计的自变量，以荧光强度为响应值，通过响应曲面优化荧光反应条件，设计因素及水平见表1。

表1 设计因素及水平表Table1 Levels and factors in Box－Benhnken experimental design

2 结果与分析

2.1 产物的最佳检测波长

邻苯二甲酸酯在碱性条件下水解生成邻苯二甲酸钠，邻苯二甲酸钠在Fe(Ⅱ)和H2O2作用下生成具有荧光的羟基邻苯二甲酸钠。按1.2.2的方法分别对DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP 和 DOP 标准溶液进行荧光激发和发射扫描，扫描结果表明:不同类型的邻苯二甲酸酯水解后的反应产物的λex和λem非常接近，最大激发波长300nm，最大发射波长410nm。

2.2 荧光反应单因素影响研究

色谱分析表明螺类样品体内DBP含量较高［12］，本实验即以DBP标准溶液为例进行单因素优化和响应面模型预测的研究。PAEs荧光反应包括酯水解生成邻苯二甲酸钠和水解产物通过Fenton反应生成具有荧光的羟基邻苯二甲酸钠两个过程，水解过程中NaOH溶液的浓度，Fenton反应缓冲溶液的pH，EDTA－Fe(Ⅱ)和H2O2用量是影响产物荧光强度的最主要因素。实验以产物的荧光强度为指标，考查了这四个因素的影响。

2.2.1 NaOH溶液的浓度的影响 结果见图1。从图1可知，在控制缓冲液pH为7.0，EDTA－Fe(Ⅱ)和H2O2用量分别为0.5、1.5mL的条件下，随着NaOH溶液浓度升高，反应物荧光强度增强，当NaOH溶液的浓度为5.0mol/L时，邻苯二甲酸酯水解最完全，荧光强度最高，继续升高 NaOH浓度，荧光强度反而下降。

图1 NaOH溶液的浓度对荧光强度的影响Fig.1 Effect of NaOH concentration on fluorescence intensity

2.2.2 Fenton反应缓冲溶液的pH的影响 结果见图2。不同pH的缓冲溶液对反应体系荧光强度影响结果表明，当pH接近中性条件时，荧光强度大且稳定;pH低于7时，荧光强度明显减弱;随着pH的升高，Fe(Ⅱ)生成沉淀，荧光值也出现下降趋势。

2.2.3 EDTA－Fe(Ⅱ)浓度的影响 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的用量对反应体系荧光强度影响见图3，由图3可以看出随着EDTA－Fe(Ⅱ)溶液用量增加，反应后产物荧光强度显著增强，当加入0.5mL 5.7×10－3mol/L的EDTA－Fe(Ⅱ)溶液时，产物荧光响应值最高，之后有所下降趋势。

2.2.4 H2O2用量的影响 结果见图4。不同H2O2量对反应体系产生荧光强度影响与EDTA－Fe(Ⅱ)不同，一开始荧光反应强度随H2O2用量的增大而增大;当H2O2的用量大于1.0～1.5mL后，荧光值稳定;继续增加H2O2用量，荧光值基本不变。

图2 缓冲溶液的pH对荧光强度的影响Fig.2 Effect of pH on fluorescence intensity

图3 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的用量对荧光强度的影响Fig.3 Effect of EDTA－Fe(Ⅱ)volume on fluorescence intensity

图4 H2O2用量对荧光强度的影响Fig.4 Effect of H2O2volumes on fluorescence intensity

2.3 响应曲面优化反应条件

为探索荧光反应体系中各条件间的交互作用，在单因素实验的基础上采用响应曲面分析法研究NaOH溶液浓度，缓冲液pH，EDTA－Fe(Ⅱ)和 H2O2用量4因素对PAEs在Fenton反应体系中产生的荧光强度的影响。实验以反应体系产生的荧光强度为响应值进行Box－Behnken设计实验，实验方案及结果见表2。

采用design expert7.0软件对表2的荧光强度和影响因素进行多元回归拟合，得到荧光强度对自变量A、B、C、D的二次多项回归方程:

对模型进行方差分析和显著性检验，结果见表3。

表2 荧光强度响应面实验设计及结果Table2 Design and experimental results of RSM

从响应面模型方差分析表可知，模型F值为23.35，概率p＜0.0001，表明模型极显著;失拟项p=0.1544＞0.05，表明由误差引起的失拟不显著;模型的确定系数值为0.95894，调整校正确定系数为0.91788，两者具有一致性，说明方程的因变量与全体自变量间线性关系明显;模型的变异系数值为8.10%，说明模型的精密度较好。

回归模型各项的方差分析结果还表明，在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序为:D＞C＞B＞A，即H2O2用量＞EDTA－Fe(Ⅱ)用量＞缓冲溶液的pH＞NaOH溶液的浓度，其中B、C、D均为高度显著项，A为显著项。交互项BC影响高度显著，其三维响应面图见图5，图中横坐标分别为Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液的 pH与 EDTA－Fe(Ⅱ)溶液加入量两个变量，3%的H2O2加入量及NaOH溶液的浓度变量已处于反应体系产生荧光强度为最高值时的值。BC影响极显著BD、CD影响显著，AB、AC、AD 影响不显著;在二次项中 A2、B2、C2和 D2的 p值均小于0.01，表明所有二次项差异高度显著。二次回归模型计算结果表明:在本实验设定的变量范围内，邻苯二甲酸酯类物质荧光反应体系产生最高荧光强度值162.3，此时最优化的各项目变量分别为:加入 0.5mL NaOH溶液的浓度为 4.61mol/L、Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液的 pH为 7.09、5.7×10－3mol/L EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的加入量为 0.55mL、3%的H2O2需加入1.63mL。依此体系反复实验，实际测得平均荧光强度为164.50，与模型预测值非常接近，误差为1.36%，充分反映曲面模型有效及具有强大的分析能力，可为实际操作提供良好的指导。

表3 响应曲面二次模型的方差分析Table3 Analysis of variance for peak areas with various extraction conditions

图5 EDTA－Fe(II)用量及缓冲液的pH交互作用对反应体系的荧光值影响的3D曲面图Fig.5 3D contour map of the influence of EDTA－Fe(II)volume and pH on fluorescence intensity

2.4 分析方法特性

2.4.1 标准曲线 在选定的最优实验条件下，以不同浓度的DBP标准液浓度为横坐标(C，10－5mol/L)，荧光值为纵坐标(F)绘制标准曲线，DBP浓度与荧光强度有良好的线性关系。回归方程为F=1.9935C+2.6809，相关系数r为0.9943。

2.4.2 加和性实验 实验分别称取表4所列6种PAEs酯，用甲醇定容至25mL，并同法称取各酯类混合物用甲醇定容至25mL进行加和性实验，结果如表4所示，实验的六种PAEs混合后浓度的测得值几乎与其累加值相同，说明不同 PAEs的荧光值可以累加。

表4 加和性实验结果Table4 Results of spectral additive property

2.4.3 回收率实验 回收率实验结果见表5，测得对照样品浓度的平均值为31.23×10－5mol/L。回收率范围为93.80%～106.11%，表明该方法适用于贝类样品邻苯二甲酸酯类的测定。

表5 回收率实验结果Table5 Results of recovery

表6 宁波市区菜市场螺蛳体内PAEs总量Table6 Analytical results of total PAEs in snails

2.5 样品分析结果

采集宁波各区内不同菜场的螺蛳，按照1.2.1方法处理后，用优化的荧光分析条件平行测定三次，结果见表6。由表6可知，样品测定的相对标准偏差为1.73%～6.56%。宁波不同地区菜市场中螺蛳PAEs的总量在26.64～44.89mg/kg之间，表明其受到了不同程度的邻苯二甲酸酯类的污染，分别采集的14个市场螺蛳样品间存在着差异性较大，间接表明蛳螺样品养殖水域中PAEs污染程度。

3 结论

通过单因素法与响应面法相结合的方法较快速、有效地得到最佳荧光反应条件为NaOH浓度4.61mol/L，Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液的 pH7.09，5.7×10－3mol/L EDTA－Fe(Ⅱ)溶液的加入量0.55mL，3%的H2O2加入量1.63mL。在优化条件下测定螺蛳样品PAEs总量，方法的回收率在93.80%～106.11%之间，在测定宁波市区菜市场螺蛳体内PAES总量时相对标准偏差为1.73%～6.56%，所检测螺蛳中PAEs达26.64～44.89mg/kg。本实验研究有助于建立快速检测螺蛳等贝类生物体内邻苯二甲酸总量的方法。

［1］王小逸，林兴桃，客慧明，等.邻苯二甲酸酯类环境污染物健康危害研究新进展［J］.环境与健康杂志，2007，24(9):736－738.

［2］胡雄星，韩中豪，刘必寅，等.邻苯二甲酸酯的毒性及其在环境中的分布［J］.环境科学与管理，2007，32(1):37－40.

［3］陈海东，鲜放鸣，邹惠仙，等.超声萃取气相色谱法测定植物样中邻苯二甲酸酯［J］.环境化学，2006，25(2):228－231.

［4］黄卫红，杨岚钦，黄婷婷，等.超声微波协同萃取－气相色谱法测定土壤中邻苯二甲酸酯类化合物［J］.分析科学学报，2010，26(3):305－309.

［5］谭君，林竹光.GC－EI－MS内标法分析鱼肉中邻苯二甲酸酯［J］.化学学报，2007，65(24):2875－2882.

［6］夏静芬，邴哲希，梅春玲.响应面法优化固相微萃取饮用水中的 DBP［J］.环境科学与技术，2011，34(11):142－146.

［7］林兴桃，王小逸，夏定国，等.固相萃取－高效液相色谱法测定人体尿液中邻苯二甲酸酯及其代谢物［J］.分析化学，2011，39(6):877－881.

［8］李拥军，熊文明，陈坚文，等.固相萃取/高效液相色谱－串联质谱法测定罗非鱼中9种邻苯二甲酸酯［J］.分析测试学报，2012，3(31):278－283.

［9］纪丽君，谢云飞，姚卫蓉.基于表面增强拉曼光谱的塑料增塑剂邻苯二甲酸酯定性筛查技术研究［J］.食品工业科技，2012，33(15):297－300.

［10］李满秀，王华燕.荧光法测定环境样品中的邻苯二甲酸酯［J］.分析化学，2005，33(9):1315－1317.

［11］李满秀，李桂琴.催化动力学荧光法测定日化品中的邻苯二甲酸酯［J］.化学研究与应用，2007，19(2):227－229.

［12］张蕴晖，陈秉衡，郑力行，等.环境样品中邻苯二甲酸醋类物质的测定与分析［J］.环境与健康杂志，2003，20(9):283－285.