正交试验优选制首乌水煎煮工艺

张振娟 刘代华 梁建成 张三平

广西科技大学附属医院 柳州市人民医院药剂科，广西 柳州 545006

制首乌为蓼科植物何首乌的干燥块根经炮制后所得，传统中医理论认为何首乌甘补兼涩，不寒不腻不燥，善补肝肾，益精血，为滋补良药。现代药理研究表明，何首乌具有调节血脂、延缓动脉粥样硬化、抗衰老、提高免疫力、益智等作用[1-2]。最新药理研究还发现何首乌的代表性成分二苯乙烯苷具有抗抑郁作用[3]，二苯乙烯苷含药血清对骨髓间充质干细胞增殖有明显促进作用[4]，临床上常用于高脂血症，在养生保健等领域也有广泛应用。通过查询文献发现，何首乌中有效成分二苯乙烯苷的提取工艺有大孔吸附树脂法[5]、超声提取法[6]、超临界 CO2萃取法[7]、乙醇回流提取法[8]，未发现临床上普遍使用的水提取（即水煎煮）方法的研究，而在水提取过程中影响有效成分溶出的因素有煎煮器具、火力、饮片大小、加水量、浸泡、煎煮时间、煎煮次数，这些因素中可控的是煎煮器具和火力，结合文献资料[9-11]及生活中实际操作的情况，本试验选择饮片大小、浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，以制首乌的代表成分二苯乙烯苷为评价指标，采用L9（34）正交试验设计、高效液相色谱法优选何首乌的最佳水煎煮工艺条件，为获得高质量的何首乌水煎剂提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-10A高效液相色谱仪 （日本岛津），SPD-10AVP紫外检测器（日本岛津），威玛多媒体色谱数据工作站，色谱柱Hypersil CN（10 μm，4.6 mm×150 mm），电子天平（BP211D型，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；A2366超声波清洗器（中船重工七院七二六所），XW-80A型离心机（上海医大仪器有限公司），针筒式微孔滤膜过滤器（水型，规格：13 mm，孔径：0.45 μm，天津市腾达过滤器件厂）。JZY-10型电动煎煮机、不锈钢煎煮锅（天津三延精密器械有限公司）。

1.2 药材和试剂

制何首乌饮片（批号：20121022）购自广西柳州百草堂药业有限公司中药饮片厂，经广西科技大学附属医院药剂科药检室鉴定为蓼科植物何首乌的干燥块根炮制品。分拣为大块：粒径25 mm左右，小块：粒径10 mm左右，粗粉：机械粉碎，过 10 目筛。对照品：2，3，5，4′-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）（中国药品生物制品检定所提供，批号：110844-201109），稀乙醇（自配：取乙醇529 mL，加水稀释至1000 mL，即得。本液在20℃时含C2H5OH应为 49.5%～50.5%mL/mL[6]）乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC 法测定 2，3，5，4′-四羟基-二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量[12]

2.1.1 色谱条件 色谱柱色谱柱为Hypersil CN（10 μm，4.6 mm×150 mm）；柱温为室温；检测波长为320 nm；流速为0.8 mL/min；流动相为乙腈-水（18∶82）；进样量为 20 μL；在上述色谱条件下，对照品和样品的色谱图见图1。

图1 对照品及制首乌HPLC色谱图

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取二苯乙烯苷对照品11.86 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成237.20 μg/mL的标准储备液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按降脂方取缺何首乌的空白样品，按供试品溶液制备阴性对照溶液。

2.1.4 系统适应性试验 取对照品溶液按《中国药典》2010年版，连续进样 5 次，RSD 为 0.46%，理论塔板数按 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯苷-2-O-β-D-葡萄糖苷计算不低于2000。取供试品溶液测定，理论塔板数按 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯苷-2-O-β-D-葡萄糖苷计算为2957，分离度为3.22，符合《中国药典》2010年版要求。

2.1.5 空白试验 吸取对照品溶液、供试品溶液、缺何首乌的阴性对照溶液，分别注入液相色谱仪，结果空白对照液在与对照品色谱相应位置上无吸收，说明空白对照液无干扰。2.1.6线性关系的考察 精密吸取上述对照品溶液10、6、4、2、1 mL，分别置于50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，分别制成浓度为 47.44、28.46、18.98、9.49、4.74 μg/mL的溶液。分别精密吸取20 μL进样，按上述色谱条件测定峰面积。以进样浓度（X）为横坐标，以峰面积值（Y）为纵坐标，计算得回归方程为 Y=1.85×10-5X＋0.375，r=0.999988，结果表明二苯乙烯苷进样量在4.74～47.44 μg/mL范围内，峰面积与进样量之间呈良好线性关系。

2.1.7 精密度试验 精密吸取61.44 μg/mL对照品20 μg/mL连续进样5次，测定峰面积，RSD为0.402%，表明仪器的精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取供试品溶液，间隔约2 h分别于0、1、3、6、8 h 进样，测定峰面积，结果 RSD 为 0.1124%（n=5），表明样品在8 h内稳定。

2.1.9 加样回收率试验 精密量取已知浓度的供试品溶液1mL，共 6 份，分别精密加入 1 mL 20.48、61.44、102.40 μg/mL 浓度供试品，各2份，测定，计算，加样回收率分别为100.79%、100.61%、100.12%、99.41%、101.53%、102.09%。

2.1.10 供试品溶液的制备及测定 称取制首乌药材9份，150 g/份，统一8倍加水量，按正交表表1的设计进行煎煮（多次煎煮者第2次及第3次的煎煮时间和加水量为第1次的一半，合并煎液），趁热过滤，浓缩定容至200 mL。取滤液15 mL离心后上清液再经滤纸、针筒式微孔滤膜过滤器过滤，取滤液2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。在上述色谱条件下取20 μL进样测定，计算。

2.2 正交试验设计

采用L9（34）正交试验设计，选择药材粒度、浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数4个因素，每个因素3个水平，因素水平见表1，试验设计结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验设计及结果

2.3 正交试验结果分析

由直观分析结果可以看出，4个因素对二苯乙烯苷的溶出量影响程度不同，依次为D＞C＞A＞B，故以B为误差项进行方差分析。在表3方差分析中可以知道，A、C、D三因素影响显著，最优水平组合为A3B2C3D3。

2.4 验证试验

取制首乌150 g三付，按最佳水煎煮工艺分别进行煎煮，取煎液按“2.1.4”项下测定二苯乙烯苷含量，分别为41.32、44.11、39.88 μg/mL。验证试验结果与正交试验结果基本吻合，说明工艺稳定可行。

表3 方差分析表

3 讨论

在煎煮过程中，粗粉煎液极其浑浊，分离困难，不论是家庭煎煮，还是医疗机构代煎都难以解决，从粒度因素的试验数据看，小块和粗粉的二苯乙烯苷溶出量比较接近，故应选择小块粒度为最佳。

从理论上讲，浸泡可以使干瘪的组织细胞膨胀，细胞间隙变大，利于溶剂的穿透浸提，但试验结果显示是否浸泡对本实验结果影响不显著，这可能是由于制何首乌质地坚硬，难以浸透，且因煎煮时间较长，因此相对于其他显著因素来说影响并不大。

二苯乙烯苷为水溶性成分，较长时间的煎煮利于其溶解渗出，从试验结果来看二苯乙烯苷的溶出率与煎煮时间呈正相关，与理论相符。

中药煎煮过程中，药材内外溶质与溶剂的浓度差是有效成分溶出的推动力，更换新溶剂即多次煎煮是保持最大浓度差最便利的手段，但多次长时间煎煮也会造成高分子杂质增多，有效成分被破坏，且会造成时间和能源的浪费，故在二煎和三煎时选定时间为头煎的一半。

综上所述，最佳工艺条件为A2B2C3D3，即粒度为小块，浸泡30 min，煎煮时间70 min，煎煮3次，第2次及第3次的煎煮时间和加水量为第1次的一半，合并煎液即可。本试验通过正交试验优选出最佳提取工艺稳定、可靠，为何首乌的水提取工艺提供了试验数据，可为获得高质量的何首乌水煎剂提供参考。

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