两株烟草根际拮抗菌的生防和促生效果研究

吴秉奇，梁永江，丁延芹，陈晓明，王玉军，徐 峥，杜秉海*

（1.山东农业大学生命科学学院，山东省农业微生物重点实验室，山东 泰安 271018；2.贵州省烟草公司遵义市公司，贵州遵义 563000；3.山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 271018）

烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var.nicotianae）是我国发生最为严重的烟草土传病害之一，其造成的年均损失约为12 303.38 万元，仅次于病毒病[1-2]。目前我国主要采用甲霜灵等化学农药来防治，但是长期使用化学农药容易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降[3]。此外，长期、反复和大量使用化学农药可引起土壤、水体和大气的污染，同时也杀伤了其他有益微生物、昆虫和畜禽，破坏了生态平衡[4]。采用抗病育种又存在时间长、抗源少等问题，抗病性与品质之间往往存在矛盾[5]。因此，生物防治越来越受到人们的重视，其中利用细菌特别是植物根际促生细菌（PGPR）防治土传病害成为生物防治的重要研究领域[6-7]。20世纪80年代以来，随着对PGPR的深入研究，发现其可以诱导植物系统抗性（ISR），成为生物防治新一轮的研究热点[8]。

目前，已经发现多种具有防治烟草黑胫病作用的根际细菌，例如地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）GP13[9]，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）C-5等[10]，但是大多数的报道局限于生防菌的防病效果及对病原菌的拮抗作用，PGPR诱导烟草系统抗性及对烟草生理指标的影响等方面的研究仍少见报道，烟草在种植过程中易受到多种细菌、真菌、病毒等病害的侵染，因此，PGPR诱导系统抗性使烟草具有对多种病害的抵抗能力在烟草生产中具有十分重要的意义。

笔者研究两株烟草黑胫病拮抗菌多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）YC0573、YC0136的防病和促生效果，并且通过测定烟草抗性相关生理指标来探讨其对烟株系统抗性的诱导作用，为生防菌在烟草田间的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 盆栽土壤 试验用土壤取自泰安当地农田，每盆装土大约 10 kg，土壤理化性质为全氮 6.41 g/kg，全磷1.13 g/kg，全钾7.20 g/kg，有机质9.89 mg/g，腐殖质2.42 mg/g，速效磷93.23 mg/kg，速效钾86.23 mg/kg，铵态氮6.58 mg/kg，硝态氮62.74 mg/kg，pH 7.31。

1.1.2 肥料与药剂 美康田佳牌复合肥（山东康田化肥有限公司），总有效成分≥40%，其中m(N):m(P2O5):m(K2O)=20:10:10，按照5 g/盆用量溶解后浇灌于土壤中。58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂（江苏宝灵化工有限公司）。

1.1.3 烟草 烟草品种为 K326，在育苗基质中培育至5～6片真叶，备用。

1.1.4 供试菌种 分离自贵州烟田根际土壤的两株多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）YC0573和YC0136，平板对峙实验中对烟草寄生疫霉（Phytophthora nicotianae var.nicotianae）均具有强烈的拮抗作用，菌株YC0136对烟草青枯病病原菌茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）也具有很强的拮抗能力。烟草黑胫病病原菌（Phytophthora nicotianae var.nicotianae）由山东农业大学植物保护学院张广民教授惠赠。其他供试菌株由本实验室筛选保存。

1.1.5 培养基 拮抗菌活化采用LB培养基，拮抗菌摇瓶发酵采用豆芽汁培养基（黄豆芽 200 g，蔗糖20 g，蒸馏水1000 mL），黑胫病病原菌活化采用燕麦培养基[10]。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 拮抗菌活化后在30 ℃、170 r/min摇瓶发酵培养 3 d，用无菌水稀释成 1×108CFU/mL。黑胫病病原菌采用杨建卿（2001）的方法[11]，制备成浓度为104个/mL游动孢子悬液。

1.2.2 试验设计 试验在山东农业大学日光温室内进行，设置4个处理，即A：接种生防菌YC0573；B：接种生防菌YC0136；C：施加甲霜灵锰锌作为药剂对照；D：发病对照。5次重复，每重复 3棵烟苗。

选择长势一致的5～6片真叶期的烟苗，移栽前将烟草幼苗在 1×108CFU/mL浓度的 YC0573或YC0136菌液中浸根30 min，然后将烟苗移栽至盆中，药剂对照和发病对照采用培养基浸根。缓苗3 d后用移液枪头将相应的菌悬液(1×108CFU/mL)灌入烟株根际，每株烟4 mL菌液，同时取1 mL菌液淋于茎基部，发病对照接入等量培养基，药剂对照采用58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂500倍稀释液浇灌处理，每盆150 mL。1 d后将配制好的黑胫病游动孢子菌悬液(104个/mL)灌接于各处理烟苗根部，接种量为5 mL/株。其余按照温室常规管理，浇水保湿以利于发病。

1.2.3 防病及促生效果调查 接种病原菌7 d后，按照文献[12]调查各处理烟株的发病情况和农艺性状，计算各处理烟株的病情指数、发病率和相对防效。烟草种植期结束后，取出烟株用清水洗净，自然条件下风干后测量烟株鲜质量，将烟株放置于烘箱中105 ℃杀青30 min，60 ℃继续烘干48 h，取出测整株干质量。

1.2.4 烟草叶片生理指标的测定 烟株移栽后30、60、90 d时，各处理取从上至下数第4片展开的叶片，剪碎混合均匀后测定以下指标，3次重复取平均值。

叶绿素含量、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定参照文献[13]，多酚氧化酶（PPO）活性采用文献[14]的方法，过氧化氢酶（CAT）采用过氧化氢分解量法测定[15]，电解质相对渗透率用电导法测定[15]。

1.2.5 烟草根系发育情况测定 烟草生长期结束后，移出整个烟株，用清水洗净风干后称取烟株地下部分鲜质量，计算烟株的根冠比。根系活力的测定采用TTC法[16]。

1.2.6 数据统计 采用SPSS 18.0软件，Duncan新复极差法，在0.05水平上分析差异显著性(p＜0.05)。

2 结 果

2.1 拮抗菌对烟草病害的防治效果

由表1看出，接种拮抗菌可推迟烟草的发病时间，烟草病情指数明显低于对照。接种 35 d后YC0573的相对防效可达到90.9%，YC0136的相对防效达到95.4%，两株拮抗菌对黑胫病的防效均高于农用药剂甲霜灵锰锌（86.4%）。

表1 拮抗菌对烟草黑胫病温室防效Table 1 Effect of tobacco black shank in greenhouse

2.2 拮抗菌对烟株生长发育的影响

由图1可以看出，YC0573、YC0136处理烟株的长势要优于甲霜灵锰锌、发病 CK，其中株高和最大叶面积 2项指标最为明显，表现在各时期YC0573、YC0136处理均与发病CK差异显著。与甲霜灵锰锌处理相比，除60 d株高外，差异也都达到显著水平。各处理烟株在60 d时长势差距较为明显，YC0573处理株高、茎围、叶数、最大叶面积分别比发病 CK提高 75.18%、17.73%、28.33%和70.92%，差异显著，和甲霜灵锰锌处理相比，茎围、叶数、最大叶面积分别高出 10.51%、26.23%、65.75%，差异显著；同时期YC0136处理株高、茎围、叶数、最大叶面积分别比发病CK高出83.71%、24.73%、23.33%和 82.58%，差异显著；与甲霜灵锰锌处理相比茎围、叶数、最大叶面积分别高出17.08%、21.31%、77.04%，差异达到显著水平。烟草生长的后期，接种生防菌的烟株依然能够表现出一定的生长优势。

由表2看出，用生防菌株处理的烟株干质量与对照间的差异均达到显著水平，YC0573、YC0136处理分别比发病CK高出53.38%和64.19%；与甲霜灵锰锌处理相比高出44.25%和54.41%。烟株鲜质量方面，YC0136处理和对照间的差异能够达到显著水平，比发病CK高出28.80%，比甲霜灵锰锌处理高出22.45%。无论是鲜质量还是干质量，甲霜灵锰锌、发病CK之间差异均不显著。

2.3 烟草叶片系统抗性相关生理指标

图1 不同生长期各处理烟株农艺性状Fig.1 Agronomic traits of tobacco in different growing phase

表2 各处理烟株生物量Table 2 Biomass of tobacco

表3 拮抗菌对烟草叶片部分生理指标的影响Table 3 Effect of antagonism bacterium on physiological index of tobacco leaves

从表3可以看出，4种处理的烟株叶片除电解质相对渗透率外的各项指标均呈现先升高再降低的趋势，处理间差异主要体现在烟株移栽后30和60 d时，即团稞期和旺长期，90 d时差异不大。60 d时生防菌处理烟株与对照间差异最为明显，7项指标的差异均可达到显著水平，YC0573处理叶绿素含量、SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性分别比发病CK高出20.77%、15.42%、17.25%、24.53%、24.60%和 35.68%，电解质相对渗透率低于发病CK 31.15%；YC0136处理叶绿素含量、SOD、POD、PPO、PAL、CAT活性分别比发病CK高出14.97%、12.12%、19.00%、27.57%、29.90%和 47.13%，电解质相对渗透率比发病CK低33.24%；甲霜灵锰锌处理各项指标中仅有PPO和PAL活性两项高于发病CK且差异显著，分别高出7.96%和16.62%，POD活性反而低于发病CK。30 d时，YC0573、YC0136处理叶绿素含量、电解质相对渗透率、PPO、PAL、CAT活性共5项指标与发病CK差异显著，YC0136处理POD含量与发病CK的差异也达到显著水平，而甲霜灵锰锌处理仅有电解质相对渗透率和 CAT活性两项指标和发病 CK差异显著。90 d时，YC0573、YC0136处理只有PPO活性与发病CK差异都能够达到显著水平，此外YC0573处理的电解质相对渗透率也与发病CK差异显著，而甲霜灵锰锌处理各项指标与发病CK间均无显著性差异。

整体上来看，两株拮抗菌对烟株叶片生理指标的影响大致相同，YC0573对叶绿素含量、SOD活性的影响更大，而YC0136对其他5项指标的影响更为明显。

2.4 烟草根系发育

表4显示，生防菌能够促进烟草根系的发育，提高烟草的根系活力，农用药剂对烟株的根系发育反而有一定的遏制。YC0573、YC0136处理地下部分鲜质量大于甲霜灵锰锌、发病CK，其中YC0136处理与发病CK差异显著，增加43.56%；YC0573、YC0136处理的根冠比与甲霜灵锰锌、发病CK相比有增大的趋势，但是差异不显著；YC0573、YC0136处理烟株根系活力分别比发病 CK高出13.13%和13.63%，差异显著；而甲霜灵锰锌处理烟株根系活力相比于发病CK有降低的趋势，但差异不显著。

表4 烟草根系发育情况Table 4 Root development of tobacco

3 讨 论

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）作为生防细菌在国内外均有报道，该菌产生的次生代谢产物对很多植物病原菌具有抑制作用，同时可以促进作物生长，诱导作物产生系统抗病性[17-18]。因其具有防病效果好、对人畜安全和无环境污染等优点而受到重视，我国农业部将其列为免做安全鉴定的一级菌种。本试验结果表明，烟草根际接种多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）YC0573和YC0136显著降低了黑胫病病情指数，接种35 d后温室相对防效分别达到90.9%和95.4%，防治效果好于甲霜灵锰锌，同时能够促进烟草的生长发育。对烟草根系发育的调查中发现两株细菌都能够不同程度的促进烟草的根部生长，根系活力高于对照，而施加甲霜灵锰锌的烟株根系活力反而略低于发病对照，这可能是因为甲霜灵锰锌抑制了土壤中某些对烟草根系发育起到重要作用的微生物所致。

研究表明，生物因子和非生物因子等多种诱导因子可诱导植物产生系统抗性[19-20]。各种诱导因子都可以诱导植物体内SOD、POD、CAT、PAL、PPO等防御酶活性的升高以及叶绿素、电解质相对渗透率等生理指标的改变。其中SOD、POD和CAT与植物体内活性氧的清除密切相关[21]，PAL和 PPO与植物体内酚类代谢和木质素的形成有关，是与系统抗性密切相关的酶[22]，叶绿素含量是衡量植物光合作用能力的大小重要指标，植物受到逆境胁迫时叶绿素含量会有所下降，电解质相对渗透率则反映了植物对病原菌抵抗力的强弱，细胞电解质渗透率小则不易受到病原菌的侵害。Liang等[21]通过分根法在黄瓜根部分别接种生防菌 L8和猝倒病病原菌发现黄瓜根部和叶片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL活性均显著升高，并且降低了黄瓜幼苗猝倒病的发病率；Vanitha等[23]研究发现番茄根际接种荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）增强了番茄对青枯病的抗性，PPO、PAL等防御酶活性显著提升，并且通过RT-PCR手段发现有关酶合成基因的表达水平显著升高；王芳等[24]从细菌B6中提取出一种活性蛋白，直接处理烟草叶片后提升了叶片PPO、POD、PAL的活性，增强了叶片对黄瓜花叶病毒的抗性。本研究发现拮抗细菌YC0573和YC0136诱导系统抗性好于化学诱导因子（甲霜灵锰锌），叶片中几种防御酶活性和叶绿素含量均显著高于对照，电解质相对渗透率比对照有所降低，同时温室试验中发现接种生防菌的烟草花叶病发病率比对照有所降低，最高幅度可达33.33%，以上结果证明两株生防细菌可诱导烟草产生系统抗性，增强烟草对病害的抵抗力。烟草移栽60 d时，生防细菌诱导系统抗性作用最为显著，此时也是烟草田间病害的高发期，诱导作用在烟草生长后期仍有一定体现。

4 结 论

本试验结果表明，温室条件下拮抗菌 YC0573和YC0136对烟草黑胫病具有良好的防治作用，同时证明了两株菌均能够诱导烟株系统抗性，具有很强的应用潜力。试验中首先对烟株浸根处理，使生防菌在烟株根部和根际土壤中占据有利的生态位点，结果显示此种处理方式生防菌的功效表现较好，这为生防菌在田间应用方式提供了有价值的参考，有关生防菌在烟草根部的定殖能力和田间应用效果还有待进一步的试验证明。

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