羧甲基槲皮素的体外抑菌活性研究

隋 阳， 郭影坤

（东北制药集团供销有限公司， 辽宁 沈阳 110023）

槲皮素(quercetin)是一种天然黄酮类化合物，其化学名为2-(3,4-二羟苯基)-3,5,7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。槲皮素据报道还具有抑菌活性[1]但是槲皮素的水溶性差，很难应用于临床。可通过在槲皮素的结构中引入亲水性基团，来增加其溶解性，以便其于吸收，从而增强其药理作用。为增强其水溶性，现将槲皮素衍生化为3′-羧甲基槲皮素钠（3′-CMQ-3Na）及 4′-羧甲基槲皮素钠(4′-CMQ-3Na)，本论文主要考察这两种水溶性槲皮素的抑菌活性。以便进一步探究这两种衍生物是否与槲皮素一样，具有其他多种药理活性，以便更好的开发、利用槲皮素，使其拥有更好的临床应用前景。

1 实验部分

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

中间普氏菌、大肠杆菌O111、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC1.2465、金黄色葡萄球菌(Wright) ATCC 49525;、肺炎克雷伯菌。

1.1.2 供试液的配制

磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：取8 g 氯化钠，0.2 g 氯化钾，2.9 g 十二水合磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾，加入1 000 mL 三蒸水。LB 液体培养基的配制：取10 g 氯化钠，10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，加入1 000 mL 三蒸水。LB 固体培养基的配制：于上述培养基加入1 000 mL 三蒸水前，加入16 g琼脂粉，其余步骤相同。CDC 液体培养基的配制：取 5 g 氯化钠，15 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，5 g大豆蛋白胨，维生素 K 10 mL,，氯化血红素 5 mg，400 mg L-半胱氨酸，加入1 000 mL 三蒸水。CDC固体培养基的配制：于上述培养基加入1 000 mL 三蒸水前，加入16 g 琼脂粉，其余步骤相同。头孢哌酮钠溶液的配制：头孢哌酮钠粉针剂在每次用前现配。将10 mL 蒸馏水注入1 g 头孢哌酮钠中混匀，并用滤膜过滤两次，药物浓度为100 mg·mL-1。替硝唑溶液的配制：按说明书配制，并在使用前用滤膜过滤两次。

1.2 实验方法

1.2.1 对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性

取100 μL 的菌种，接入到LB 培养基中，在37 ℃，160 r·min-1的条件下振摇 24 h。收集细菌，于 4 ℃，6 000 r·min-1条件下离心 10 min，然后弃上清，用PBS 重悬并集于一个EP 管内。将菌液依次稀释106、107、108、109 倍，分别涂到LB 固体培养板上，倒置于37℃保温箱内20 h,计数。每个样品量均为20 mL，将菌液加入到无菌的LB 液体培养基，并用此培养基将经2 次滤膜过滤的3′-羧甲基槲皮素钠及 4′-羧甲基槲皮素钠进行稀释，调整 3′-羧甲基槲皮素钠浓度至0.05, 0.025, 0.0125 , 0.00625 mg·mL-1，4′-羧甲基槲皮素钠浓度至 0.2, 0.1 , 0.05 ,0.025 mg·mL-1。同时设置 20 mL 无菌的 LB 为空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液为阴性对照（-）；在加入了菌液的LB 中再加入新鲜配制的头孢哌酮钠溶液，使头孢哌酮钠的终浓度为 1 mg·mL-1，此20 mL母液作为阳性对照（+）。菌液的终浓度均调整为107 cfu•mL-1。每隔4 h 用紫外可见分光光度计测样品的吸光值，波长为600 nm，连续测2 h[2]。

1.2.2 对金黄色葡萄球菌(Wright)的抑菌活性

取100 μL 的菌种方法同前，调整两化合物浓度均至 0.2, 0.1 , 0.05 , 0.025 mg•mL-1。同时设置 20 mL无菌的LB 为空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液为阴性对照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鲜配制的头孢哌酮钠溶液，使头孢哌酮钠的终浓度为1 mg•mL-1，此 20 mL 母液作为阳性对照（+）。菌液的终浓度均调整为107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可见分光光度计测样品的吸光值，波长为 600 nm,连续测24 h。

1.2.3 对肺炎克雷伯菌的抑菌活性

取100 μL 的菌种方法同前，调整两化合物浓度均至 0.8, 0.4 , 0.2, 0.1 mg·mL-1。同时设置 20 mL 无菌的LB 为空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液为阴性对照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鲜配制的头孢哌酮钠溶液，使头孢哌酮钠的终浓度为 1 mg·mL-1，此 20 mL 母液作为阳性对照（+）。菌液的终浓度均调整为107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可见分光光度计测样品的吸光值，波长为 600 nm,连续测24 h。

1.2.4 对大肠杆菌的抑菌活性

取100 μL 的菌种方法同前，调整两化合物浓度均至 1.6 , 0.8 , 0.4, 0.2 mg·mL-1。同时设置 20 mL 无菌的LB 为空白；加入了菌液的LB 20 mL 母液为阴性对照（-）；在加入了菌液的 LB 中再加入新鲜配制的头孢哌酮钠溶液，使头孢哌酮钠的终浓度为 1 mg·mL-1，此 20 mL 母液作为阳性对照（+）。菌液的终浓度均调整为107 cfu·mL-1。每隔4 h 用紫外可见分光光度计测样品的吸光值，波长为 600 nm,连续测24 h。

1.2.5 对中间普氏菌的抑菌活性

在CDC 血平板上厌氧培养96 h，经鉴定后将数个典型菌落混悬于CDC 液体培养基，于CDC 液体培养基中厌氧培养48 h，用血球计数板计数。用无菌的CDC 液体培养基对经2 次滤膜过滤的3′-羧甲基槲皮素钠及4′-羧甲基槲皮素钠进行稀释，再加中间普氏菌菌液，调整 3′-羧甲基槲皮素钠及 4′-羧甲基槲皮素钠终浓度均为 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 mg•mL-1。同时设置无菌的CDC 为空白；加入了菌液的 CDC 母液为阴性对照（-）；在加入了菌液的CDC 中再加入配制好的替硝唑溶液，使替硝唑的终浓度为 1 mg•mL-1，此母液作为阳性对照（+）。菌液的终浓度均调整为 107 cfu•mL-1。将青霉素小瓶于37℃、厌氧培养，每隔6 h 用紫外可见分光光度计测样品的吸光值，波长为620 nm，连续测36 h。

2 结果与讨论

2.1 对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。3′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.05 mg•mL-1，抑菌率（BIR）[3]为98.8%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。4′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的 MIC 为0.05 mg•mL-1，BIR 为92.4%，抑菌效果良好。

2.2 对金黄色葡萄球菌(Wright)的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。3′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的MIC 为0.1 mg•mL-1，BIR 为87.3%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。4′-羧甲基槲皮素钠对金黄色葡萄球菌的MIC 为0.1 mg•mL-1，BIR 为78.6%，抑菌效果良好。

2.3 对肺炎克雷伯菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素钠对肺炎克雷伯菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。3′-羧甲基槲皮素钠对肺炎克雷伯菌的 MIC 为 0.8 mg•mL-1，BIR 为83.9%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素钠对肺炎克雷伯菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。4′-羧甲基槲皮素钠对肺炎克雷伯菌的 MIC 为 0.8 mg•mL-1，BIR 为 87.5%，抑菌效果良好。

2.4 对大肠杆菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素钠对大肠杆菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。3′-羧甲基槲皮素钠对大肠杆菌的MIC 为1.6 mg•mL-1，BIR为100%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素钠对大肠杆菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。4′-羧甲基槲皮素钠对大肠杆菌的MIC 为1.6 mg•mL-1，BIR为97.9%，抑菌效果良好。

2.5 对中间普氏菌的抑菌效果

(1) 3′-羧甲基槲皮素三对中间普氏菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。3′-羧甲基槲皮素钠对中间普氏菌的 MIC 为 0.05 mg•mL-1，BIR 为100%，抑菌效果良好。

(2) 4′-羧甲基槲皮素钠对中间普氏菌的抑菌效果。随着药物浓度的增加，抑菌活性逐渐增强。4′-羧甲基槲皮素钠对中间普氏菌的 MIC 为 0.05 mg•mL-1， BIR 为 99.8%，抑菌效果良好。

2.6 3′-羧甲基槲皮素钠及 4′-羧甲基槲皮素钠的抑菌活性比较

3′-羧甲基槲皮素钠及 4′-羧甲基槲皮素钠的抑菌活性比较见表1 和图1。

表1 3′-羧甲基槲皮素钠及4′-羧甲基槲皮素钠的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of 3-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin

图1 3′-羧甲基槲皮素钠及4′-羧甲基槲皮素钠对不同细菌的最小抑菌浓度Fig.1 Minimal inhibitory concentrations of 3-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin for different bacteria

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Wright)均为革兰阳性菌，两种化合物对其抑菌作用明显。肺炎克雷伯菌、大肠杆菌均为革兰阴性菌，两种化合物对其也具有抑菌作用，但没有革兰阳性菌明显。中间普氏菌也属于革兰阴性菌，同时又属于厌氧菌，两种化合物对其也具有明显的抑菌作用。

通过抑菌率的比较进一步说明了 3′-羧甲基槲皮素钠及4′-羧甲基槲皮素钠的抑菌作用良好，且对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)的抑菌作用强于金黄色葡萄球菌(Wright)。同时对既属于革兰阴性菌，又属于厌氧菌的中间普氏菌，也具有非常明显的抑制作用见图2。

图2 3′-羧甲基槲皮素钠及4′-羧甲基槲皮素钠在对不同细菌的最小抑菌浓度下的抑菌率Fig.2 Bacterial inhibition rates of 3′-carboxymethylquercetin and sodium 4′-carboxymethylquercetin under the minimum inhibitory concentration for different bacteria

3 结 论

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Wright)均为革兰阳性菌，大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均为革兰阴性菌，3′-羧甲基槲皮素钠及4′-羧甲基槲皮素钠对革兰阳性菌抑菌作用明显优于革兰阴性菌。并且金黄色葡萄球菌(Wright)比金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌浓度高一倍。这些也为深入研究其作用机制提供了方向。另外，同样是革兰阴性菌的大肠杆菌与肺炎克雷伯菌相比，最小抑菌浓度却要大了一倍，原因可能是人体食用的植物性食物中含有槲皮素，经长期进化，人体内大肠杆菌对槲皮素可能产生了耐药性，而且大肠杆菌确实存在耐药性[4]。另外，肺炎克雷伯菌也具有一定的耐药性[5]，尤其与其他细菌相比，具有略高最小抑菌浓度的肺炎克雷伯菌是否对槲皮素也具有耐药性仍有待考察。另外，从抑菌率中还发现 3′-羧甲基槲皮素钠比 4′-羧甲基槲皮素钠的抑菌效果略好。3′-羧甲基槲皮素钠及4′-羧甲基槲皮素钠对革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、金黄色葡萄球菌(Wright)，革兰阴性菌如肺炎克雷伯菌、大肠杆菌，及其中的厌氧菌如中间普氏菌，均有良好的抑菌作用。结果揭示 3′-羧甲基槲皮素钠及 4′-羧甲基槲皮素钠与槲皮素具有类似的抗菌活性，这为进一步探究水溶性槲皮素衍生物的药理活性提供了可能，也为日后临床开发槲皮素奠定了一定的基础。

［1］ 秦晓蓉, 张铭金. 槲皮素抗菌活性的研究[J]. 化学与生物工程,2009, 26 :55-57;78.

［2］ 马建凤, 刘华钢, 朱丹. 中药体外抑菌研究的方法学进展[J]. 药物评价研究, 2010,33 (1):42-45

［3］Malkoskim K. A novel antibacterial milk[J]. Antimicrob.Agents Chemother, 2001, 8:2309-2315.

［4］ 张小林,汪复,朱德妹.多重耐药大肠杆菌中的主动外排机制[J]. 中华传染病杂志, 1995, 17(2):85-87.

［5］ 陈求刚, 李银珍, 周文,等. 多重耐药肺炎克雷伯菌耐药基因的初步定位研究[J]. 中国热带医学, 2007, 7(03):337-338.