传导加热和微波加热对卵清蛋白糖基化产物一级结构的影响

王 辉，涂宗财，2，* ，刘光宪，石 燕，肖 辉

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，生物质转化教育部工程研究中心，江西南昌330047;2.江西师范大学，江西南昌330022;3.江西省农业科学院农产品加工中心，江西南昌330000;4.美国叶史瓦大学爱因斯坦医学院，纽约10461)

蛋白质和还原糖之间的非酶褐变(Maillard 反应)是非常普遍的一种现象，已经有很多年的研究历史。Maillard 反应是一个非常复杂的反应链，整个反应可以分为初级反应阶段、中级反应阶段和高级反应阶段［1］。其反应的第一步即是糖类与蛋白质中的赖氨酸上的ε-氨基或者蛋白质的氮末端氨基失水发生糖基化修饰反应，通过对蛋白质的糖基化修饰，可以达到对蛋白质改性的目的［2-3］。Maillard 反应是食品化学领域的重要反应，通过Maillard 反应对蛋白质进行糖基化修饰［4］，以期达到蛋白质改性的目的是食品蛋白质改性研究的主要手段之一。目前对蛋白质进行糖基化修饰改性的研究多集中于采用干加热、贮存等方法来实现蛋白质的糖基化修饰［5-6］，但是对于糖基化蛋白质一级结构及修饰位点的研究较少。传导加热和微波加热是人们生产生活中常用的加热方式，但是二者加热原理并不相同，其中，传导加热是靠热量的传递进行加热，微波加热是靠微波能转化为热量达到加热的目的。因此对食品内体系的影响可能也不相同。微波加热是一种安全、快速的加热和干燥食品的方法，微波加热对糖基化修饰的研究已有报道，Yasuhiro 等［7］人采用SDS- PAGE 比较了传导加热(CH)和微波加热(MWH)条件下卵清蛋白糖基化产物的分子量变化，发现其电泳条带随着加热时间的延长发生向上偏移;Guan 等人研究了微波对大豆蛋白糖基化修饰的影响，其结论是两种加热方式没有明显的区别［8］。基于目前的国内外研究现状，本文以卵清蛋白为原料，采用质谱分析技术，对传导加热和微波加热条件下生成的糖基化卵清蛋白的一级结构进行研究，并分析比较贮藏时间对两种糖基化卵清蛋白的稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

FT-ICR MS 美国Varian 公司;配两个LC-10AD泵的液相 日本岛津公司;1.0mm ×50mm C3柱子 美国Micro-Tech Scientific 公司。

D-葡萄糖 Sigma 公司;卵清蛋白Ⅳ Sigma 公司;胃蛋白酶 Sigma 公司;其他化学试剂 均为sigma 分析纯和色谱纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 传导加热和微波加热条件下制备糖基化卵清蛋白 采用pH7.8 Tris HCL 溶液在8 个1mL 的离心管中配制20mg/mL 卵清蛋白、10mg/mL 葡萄糖混合溶液各100μL，真空干燥得固体混合物样品(水分含量2.34% ± 0.2%)。分别取4 管样品各置80℃和200W 的微波条件下加热30min，移取200μL 的超纯水将糖基化卵清蛋白完全溶解，采用5000 分子量滤膜除去多余葡萄糖，真空干燥后，一半样品进行检测，一半样品置-20℃冰箱中贮存30 天后检测。

1.2.2 巯基还原及乙酰化处理参照文献［9］ 添加10μL 200mmol/L DTT(二硫苏糖醇)溶液于样品溶液中，混匀，室温条件下放置1h;添加50μL 200mmol/L碘乙酰胺溶液于样品溶液中，混匀，室温条件下放置1h;添加50μL 200mmol/L DTT 溶液于样品溶液中，混匀，室温条件下放置1h。添加690μL 超纯水至样品溶液中，备用。

1.2.3 胃蛋白酶酶解参照文献［9］ 移取0.5μL 还原乙酰化后的卵清蛋白样品溶液于20μL，pH2.2 的盐酸溶液中，添加5μL，1%的胃蛋白酶溶液，在0℃条件下酶解10min，移取20μL 酶解液上样。

1.2.4 LC FT-ICR MS 检测分析参照文献［9］ 将脱盐后的样品配成50μg/μL 的水溶液，取样25μL 上液相，采用双泵微米级液相进行梯度洗脱，流动相A:5%乙腈，0.1% 甲酸水溶液;流动相B:95% 乙腈溶液。洗脱梯度为:0～2min，98% A，2% B;3min，85%A，15% B;8min，70% A，30% B;9min，50% A，50%B;10～13min，5% A，95% B;14min，95% A，5% B;15min，STOP。流速为0.05μL/min，液相设备与FT-ICR直接连接，在0min 时采集图谱，采集时间为15min。

2 结果与讨论

2.1 传导加热和微波加热的温度变化曲线

温度是Maillard 反应的最重要的参数，为了从根本上比较传导加热和微波加热对卵清蛋白Maillard糖基化修饰的影响，本文建立了传导加热和微波加热条件下超纯水的温度变化曲线，如图1 所示，该曲线的建立与Yasuhiro［7］等人采用卵清蛋白和葡萄糖混合物在不同加热条件下的温度曲线建立的方法不同，主要原因是超纯水在传导加热和微波加热过程中，温度提高所吸收的功率是相同的，而卵清蛋白和葡萄糖混合物均为固体，在传导加热过程中的温度升高和微波条件下的温度升高所需功率并不相同，可比性不大。因此本论文建立了传导加热和微波加热条件下超纯水的温度变化曲线。

图1 水在80℃传导加热和200W 微波加热过程中的温度曲线变化图Fig.1 Temperature profile of water subjected to conductive heating and microwave heating

上图中传导加热温度为80℃，微波加热功率为200W，由图可见，80℃传导加热温度和200W 微波加热的温度曲线图基本相吻合，因此，本论文对卵清蛋白的糖基化修饰分别采用80℃传导加热温度和200W 微波加热，比较两种加热方式对卵清蛋白糖基化修饰程度的不同。

2.2 糖基化卵清蛋白的一级结构

近年来，随着质谱技术的发展，糖基化蛋白质的一级结构研究及位点分析取得了较大进展，通过测序级胰蛋白酶［10-11］、AspN［12］特异性蛋白酶酶解和MALDI、Q-TOF MS 等质谱技术结合可以准确地对糖基化蛋白的一级结构及位点进行研究，但是由于胰蛋白酶酶解的特异性位点恰恰为易发生糖基化修饰的赖氨酸和精氨酸，而AspN 的酶活相对较差，检测比较困难，蛋白质的覆盖率较低，因此本论文采用胃蛋白酶对蛋白质进行短时间酶解，利用FT-ICR MS对酶解后多肽进行质谱分析。

表1 为传导加热和微波加热得到的糖基化卵清蛋白的主要肽段及糖基化位点，结果表明，对照卵清蛋白中赖氨酸17、47、56、62、93、182、190、323、370 均发生一定程度的糖基化修饰，经过传导加热和微波加热处理后，卵清蛋白上的所有赖氨酸均发生了糖基化修饰，两种加热方式都会导致卵清蛋白发生Maillard 初级反应，得到糖基化修饰产物。蛋白质中的精氨酸和氮末端氨基也会与还原糖发生美拉德反应，但是，通过对相关肽段的分析，未发现卵清蛋白中的精氨酸和氮末端氨基发生糖基化修饰的质谱峰。

2.3 贮存30d 后糖基化卵清蛋白的一级结构变化

蛋白质的糖基化修饰是蛋白质与还原糖发生的Maillard 反应的初级阶段，该糖基化修饰产物不稳定，在加热、长期贮藏或人体生理活动中极易进一步进入Maillard 反应的中级和高级阶段，从而生成类黑精等物质，导致蛋白质中赖氨酸、精氨酸的破坏和营养损失。另外，糖基化蛋白质进行质谱定位分析时，CID 裂解过程中，蛋白质修饰的糖基上易发生多项中性丢失(如H2O、2H2O、3H2O、4H2O、3H2O +HCHO 和C6H10O5)峰为MSMS 图谱中的主要质谱峰，从而生成oxonium ion(正氧离子)、pyrylium ion(鎓离子)and iminium ion(亚铵离子)等等离子［13］。本研究中发现，与传导加热得到的糖基化卵清蛋白修饰相比，微波加热导致的糖基化卵清蛋白贮存30d 后，部分赖氨酸上的糖基化修饰会发生逐渐失水和降解反应，主要包括47、56、62、227 或229，其中质谱峰为m/z 732.41483+的肽段的失水降解最严重，其降解产物与CID 源裂解糖基化肽生成的部分中性丢失相同，如图2 所示。

表1 传导加热和微波加热得到的糖基化卵清蛋白的主要肽段及糖基化位点Table 1 Peptides and glycation site identified in glycated ovalbumin under conductive heating and microwave heating treatment

表2 传导加热和微波加热得到的糖基化卵清蛋白贮存30d 后一级结构的变化Table 2 Change of first-order structure of the glycated ovalbumin under conductive heating and microwave heating treatment after 30d

由图2 可以看出，微波加热产生的糖基化卵清蛋白在贮存过程中很不稳定，易发生酮糖上失水等降解反应，而反应产物与CID 源裂解糖基化肽产生的碎片极为相似，降解产物如图2 中标示，但是传导加热产生的糖基化卵清蛋白未发生类似反应，这可能与传导加热和微波加热的作用原理不同有关，微波加热过程中使蛋白质的糖基化修饰侧链以极高的频率振荡，引起分子的电磁振荡等作用，从而增加分子的运动，使糖基上的分子结构变得不稳定，从而导致糖基化卵清蛋白在贮存30d 后发生降解，该研究结果为微波技术在蛋白质组学、食品科学、医学等领域中的糖基化蛋白质研究方面提供了一定的参考。

图2 微波加热的糖基化卵清蛋白贮存30d 后酶解肽段m/z 732.41483+［VYLGAKDSTRTQINKVVRF］的一糖化肽失水降解ESI/FT-ICR MSFig.2 ESI/FT-ICR MS of m/z 732.41483+［VYLGAKDSTRTQINKVVRF］of the glycation peptide digestion glycation Oval.treated by MWH after 30d

3 结论

综上分析，在相同功率的传导加热和微波加热过程中，卵清蛋白均可与葡萄糖发生Maillard 初级反应，生成糖基化卵清蛋白产物，但是在贮存过程中，传导加热导致的糖基化卵清蛋白的稳定性更高，微波加热导致的糖基化卵清蛋白易发生酮糖上的失水等降解反应，而反应产物与CID 源裂解糖基化肽产生的片段相似，研究结果为微波技术在蛋白质组学、食品科学、医学等领域中的糖基化蛋白质研究方面提供了一定的参考。

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