预处理对干燥罗非鱼片蛋白质变性的影响及优化

郑 曼，关志强 ，李 敏，吴宝川，康 彦

(广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088)

罗非鱼是我国当前重要的淡水养殖品种之一，也是我国最具国际竞争实力、最具产业化发展前景的品种。因其肉质鲜美、细嫩，含有丰富的蛋白质和多种不饱和脂肪酸，日益受到人们的广泛青睐。2009 年，我国罗非鱼产量为125.7 万t，占全球产量的三分之一以上［1-3］。罗非鱼等水产原料大多含有较高的水分，生产季节性强，原料易于腐败，必须采取有效手段对原料进行及时保鲜和加工处理。干燥是鱼类保藏的常用技术，是许多食品加工中不可缺少的环节，也是一个复杂的工艺过程［4-5］。由于罗非鱼鱼肉含有丰富的蛋白质、脂肪等营养成分，这些成分经不同温度的加热处理后的变化情况不同，肌肉蛋白质的结构和化学性质发生变化，严重影响了消费者的口感和对营养成分的需求［6-7］。关于水产品冷冻引起蛋白质变性以及抗冻剂的研究，国内外专家学者已做了不少值得借鉴的工作［8-10］，关于食品干燥前预处理方面的研究主要集中在果蔬类［11-14］，而鱼类干燥过程蛋白质的热变性及品质改良的研究却鲜有报道。本文以大宗罗非鱼为原料，采用热泵干燥，以Ca2+-ATP 酶活性、盐溶性蛋白溶解度和组织切片为指标，研究了干燥预处理对干制罗非鱼片蛋白质变性作用的影响，为高品质干燥罗非鱼的工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼 购于湛江市霞山海鲜市场。试剂 丙二醇，丙三醇，NaCl 均为食品级。

热泵干燥装置(自建)［15］;岛津UV-1800 紫外分光光度计;DZF-6050 型真空干燥器:上海精宏实验仪器有限公司;JA 2003A 型电子分析天平:上海精密科学仪器有限公司;YD2202 切片机，浙江省金华市益迪医疗设备厂;摄像显微镜，日本奥林巴斯出厂。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 原料鱼→制取鱼片→预处理→热泵干燥→指标检测

1.2.2 操作要点 制取鱼片:将新鲜的罗非鱼去头尾、去内脏、去鱼鳞后，清洗干净，从鱼脊骨上方开始取肉，两侧各取一片，去骨，然后对鱼片进行去皮整形，控制鱼片大小为50mm×40mm×4mm(±1mm)，约重15g。预处理:根据国家标准GB 2760-2011 食品添加剂使用标准确定丙二醇、丙三醇的添加量为1% ～5%。因此单因素实验中在鱼片表面分别添加丙二醇、丙三醇、NaCl 进行浸渍，添加量为1%，2%，3%，4%，5%，每小时搅拌1 次，浸渍3h。对照组不添加。在单因素实验的基础上，分别以丙二醇，丙三醇，NaCl 的添加量为自变量，以Ca2+-ATPase 活性为响应值，进行响应面实验设计与分析。表1 为实验设计水平编码表。

表1 响应面实验因素和水平编码表Table 1 Factors and the levels coding of experiment of response surface analys

热泵干燥:用吸水纸吸取鱼片表面水分，整齐地摆放在不锈钢网上。在温度分别为30、45、60℃，风速2.5m/s，湿度28%～34%的条件下将鱼片干燥至含水量为28%～30%。每个实验重复3 次。

1.2.3 检测方法

1.2.3.1 Ca2+-ATPase 活性的测定 采用ATP 酶检测试剂盒测定。ATP 酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。Ca2+-ATPase 活性以在25℃时每毫克蛋白质在每小时内所产生的无机磷的微摩尔数表示，单位为μmol Pi/mg prot/h。

式中:A1-干燥样品鱼肉的Ca2+-ATPase 活性;A2-新鲜鱼肉的Ca2+-ATPase 活性。

1.2.3.2 盐溶性蛋白的测定 准确称取3g 鱼肉充分研碎，用10 倍体积磷酸盐缓冲液(I =0.05，pH7.5)提取1h，在4000r/min 下离心10min，去除上清液，重复两次，沉淀肉用10 倍体积的Weber-Edsall 溶液(0.6mol/L KCl - 0.01mol/L Na2CO3- 0.04mol/L NaHCO3)在4℃的环境中提取20h，不断搅拌，在6000r/min 下离心10min，取上清液，采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。

1.2.3.3 组织切片的观察 采用Bouin 氏液对组织样品进行固定，经过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，石蜡切片机切片，采用H.E 染色方法对组织切片进行染色，然后显微影像10 ×10 倍放大摄影观察。

2 结果与分析

2.1 预处理对干燥罗非鱼片Ca2 +-ATPase 活性影响的单因素实验

干燥过程中，由于蛋白质分子与结合水的结合状态被破坏，导致蛋白质变性，使鱼肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase 活性下降，Ca2+-ATPase 活性大小能够直接反映出肌球蛋白的变性程度，广泛用来作为反映鱼肉蛋白变性的指标。由图1 可知，在添加量小于4%的情况下，分别经丙二醇、丙三醇和NaCl 浸渍得到的干制罗非鱼片的Ca2+-ATPase 活性均高于对照组(添加量为零)，即能够有效抑制鱼肉蛋白在干燥过程中的热变性。随着预处理试剂添加量的增加，干燥罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性呈现先升高后降低的趋势。丙二醇、丙三醇和NaCl 的添加量分别为3%、3%、1%时，干制罗非鱼片的Ca2+-ATPase 活性达到最大值。因此在响应面优化实验中预处理添加量的选取范围取丙二醇2% ～4%，丙三醇2% ～4%，NaCl 0～1%。

图1 45℃干燥条件下不同预处理对干燥罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性的影响Fig.1 Effect of different pretreatments on Ca2+-ATPase activity of tilapia fillets under 45℃

按照Box-Behnken 实验方案进行三因素三水平实验，结果见表2。将所得的数据用Design Expert 软件最小二乘法拟合，得到预处理添加剂丙二醇(x1)、丙三醇(x2)和NaCl(x3)的二次多项回归方程为:

2.2 预处理工艺模型建立及响应面分析

由表3 方差分析可知，回归方程的p ＜0.0001(极显著)，由表3 可知失拟合p =0.1817(不显著)，表明方程对实验拟合良好，实验误差小。模型的总决定系数R2=0.9981，即有99.81%的正确性来表明响应值的变化。利用此模型可以对预处理工艺对干燥罗非鱼Ca2+-ATPase 活性的影响进行分析和预测。

该模型能较好地反映出丙二醇、丙三醇和NaCl的添加量与干燥罗非鱼Ca2+-ATPase 活性的关系。由表3 可以看出，二次项x22、x32，交互项x1x3、x2x3，一次项x1、x3对干燥罗非鱼Ca2+-ATPase 活性的影响显著。图4～图6 分别显示了x1x2、x1x3、x2x3的并互影响作用，图形越陡等高线越密集，则交互作用越显著，交互作用的排序为x2x3＞x1x3＞x1x2，这与方差分析中的结果一致。由响应面模型得出最优预处理工艺为:丙二醇2% +丙三醇3.01% +NaCl 0.95%，在该条件下干燥罗非鱼 Ca2+- ATPase 活性为3.2331μmol Pi/mg prot/h。选取最佳条件:丙二醇2% +丙三醇3% +NaCl 1%，进行验证性实验，得到干燥罗非鱼片的Ca2+-ATPase 活性为3.23μmol Pi/mg prot/h。

表2 罗非鱼干燥预处理工艺响应面实验设计及结果Table 2 Arrangement and result of response surface analysis about pretreatment condition

表3 罗非鱼干燥预处理工艺响应面实验结果方差分析表Table 3 ANOVA for the pretreatment condition response surface mode

2.3 预处理对干制罗非鱼片蛋白质变性及组织结构的影响

选取上述优化后的预处理配方(丙二醇2% +丙三醇3% +NaCl 1%)，对罗非鱼片进行干燥预处理，并与未经预处理的对照组比较，分析预处理对干制罗非鱼片蛋白质变性及组织结构的影响。

图2 丙二醇和丙三醇响应面立体分析Y=f(x1，x2)Fig.2 The response surface graph，Y=f(x1，x2)

图3 丙二醇和NaCl 响应面立体分析Y=f(x1，x3)Fig.3 The response surface graph，Y=f(x1，x3)

图4 丙三醇和NaCl 响应面立体分析图，Y=f(x2，x3)Fig.4 The response surface graph，Y=f(x2，x3)

2.3.1 预处理对干制罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性的影响 由图5 可知，三种干燥温度下得到的罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性的变化率都在50%以上。干燥温度对罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性有显著影响，干燥温度越高，干燥罗非鱼的Ca2+-ATPase 活性越小。同一干燥温度下，经过预处理的罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性的下降受到很大程度的抑制，明显高于空白对照组，干燥温度为30、45、60℃时分别提高8.3%、13.5%和6.3%。

2.3.2 预处理对干制罗非鱼片盐溶性蛋白溶解度的影响 由图6 可知，干燥温度对罗非鱼片的盐溶性蛋白溶解度有显著影响，干燥温度越高，干燥罗非鱼的盐溶性蛋白溶解度越小。同一干燥温度下，经过预处理的罗非鱼片盐溶性蛋白溶解度明显高于空白对照组，干燥温度为30、45、60℃时分别提高19.4%、11.5%和10.6%。表明预处理可提高盐溶性蛋白的溶解度，有效改善鱼片的干制品质。

2.3.3 预处理对干制罗非鱼片组织结构的影响 将新鲜罗非鱼片样品和经过预处理试剂预处理后并在不同干燥温度条件下干制的样品进行组织切片分析，其结果如图7～图10 所示。

图5 预处理对罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性的影响Fig.5 Effect of pretreatment on Ca2+-ATPase activity of tilapia fillets

图6 预处理对罗非鱼片盐溶性蛋白溶解度的影响Fig.6 Effect of pretreatment on salt-solubility of myofibrillar protein of tilapia fillets

图7 新鲜罗非鱼纵、横切片Fig.7 The vertical and across cutting film of fresh tilapia

由图7 可以看出，新鲜鱼片由于含水率较高，肌肉组织结构清晰，排列有序，肌肉细胞完整性保持良好。图8、图9 和图10 与图7 对比可以看出，干制后其组织结构发生了很大的变化，且与无添加相比，添加预处理试剂后鱼片的组织结构能得到有效的改善。

图8 30℃干燥罗非鱼纵、横切片Fig.8 The vertical and across cutting film of tilapia dried under 30℃

根据细胞生物学的概念，细胞结构的破坏会导致细胞液的大量流失，使维持细胞内部结构稳定的因素被破坏，这就极易导致酶活性的下降和肌球蛋白的变性。由图7～图10 比较可以看出，干燥鱼片和新鲜鱼片的组织结构有明显的差异。不论是否经过预处理，干燥温度高低，罗非鱼的肌肉组织结构都遭到了破坏。表现为:肌细胞的间隙减小，细胞受到机械损伤发生破裂，肌纤维挤压在一起，使纤维结构排列无序化;肌纤维发生局部断裂，呈现收缩致密的结构特征［16］。干燥温度越高，鱼片细胞和纤维组织破坏程度越严重。30℃得到的干制鱼片组织结构纹理清晰，排列整齐，变形程度小。而60℃得到的干制鱼片组织结构破坏严重，细胞间隙已连成块甚至连成片，说明部分细胞已破坏，肌细胞基本上没有完整的形态。同一干燥温度下，经预处理的鱼片组织结构相对清晰，排列整齐，变形程度小。说明预处理能有效减少鱼片组织结构的变形，改善干品品质。

图9 45℃干燥罗非鱼纵、横切片Fig.9 The vertical and across cutting film of tilapia dried under 45℃

3 结论

3.1 以Ca2+-ATPase 活性为指标，利用响应面优化分析得到最佳预处理工艺:丙二醇2% +丙三醇3%+NaCl 1%，此预处理条件下得到的干燥罗非鱼片Ca2+-ATPase 活性为3.23μmol Pi/mgprot/hour。

3.2 干燥温度对罗非鱼片的Ca2+-ATPase 活性、盐溶性蛋白溶解度及组织结构有显著影响，干燥温度越高，鱼片Ca2+-ATPase 活性和盐溶性蛋白溶解度越小，组织结构破坏程度越严重。

图10 60℃干燥罗非鱼纵、横切片Fig.10 The vertical and across cutting film of tilapia dried under 60℃

3.3 预处理能有效防止鱼片干燥过程的蛋白质变性，明显减少肌肉组织的机械损伤，有效保护细胞的完整性和肌纤维排列的有序性。使用预处理剂处理鱼片，能防止鱼片蛋白质变性，有效改善干鱼片品质。

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