蛋壳内膜酶解及其酶解液体外抗氧化活性研究

李 鑫，赵 燕，* ，涂勇刚，李建科，喻 盼，卲兰兰

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047;2.南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，江西南昌330047;3.江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045)

禽蛋由蛋壳、蛋白和蛋黄三大部分组成，各部分具有不同的形态结构和生理功能［1］。但目前禽蛋被利用的部分几乎只有蛋清和蛋黄，蛋壳的利用率极低，绝大多数被废弃。废弃的蛋壳，包括蛋壳与蛋壳内膜，含有丰富的钙、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、角蛋白和溶菌酶等成分［2-3］;据报道［4-8］，透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白及其水解肽均具有一定的抗氧化活性。我国是世界上禽蛋生产和消费最多的国家，废弃的蛋壳造成资源的极大浪费，也对环境造成了不小的污染［2］。基于此，对蛋壳进行研究和深加工特别必要。目前，蛋壳的利用多数是添加到饲料中，用于动物补钙［9］，也有关于利用蛋壳制备有机酸钙［10-12］和煅烧合成羟基磷灰石［12］的研究报道;对蛋壳内膜的研究主要集中在对角蛋白、胶原蛋白［3］、透明质酸［13］、硫酸软骨素［14］等的提取分离，蛋壳内膜功能食品的开发［15］，蛋壳内膜酶解［16］和蛋壳内膜吸附作用［17］等方面，由于壳膜分离存在难度，蛋壳内膜的实际应用不多。为提高蛋壳的总体利用价值，本实验用蛋白酶酶解蛋壳内膜，考察其酶解液的抗氧化能力，以初步了解蛋壳内膜的一些功能特性，为蛋壳内膜的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛋壳内膜 购自于药店;中性蛋白酶 无锡市雪梅酶制剂科技公司，50000U/g;碱性蛋白酶 广州市齐云生物技术有限公司，200000U/g;胰蛋白酶 广州市齐云生物技术有限公司，250U/mg;木瓜蛋白酶 上海蓝季科技发展有限公司，1000000U/g;1，1-二苯基-2-苦基肼(即DPPH 自由基) 美国Sigma 公司;硫酸亚铁、邻菲罗啉、钼酸铵、无水乙醇、硫酸、双氧水、PBS 缓冲液、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 均为分析纯。

UV2800 紫外-可见分光光度计 上海尤尼珂;FA1104 电子天平 上海HANGPING;TDL-5-A 离心机 上海安亭科学仪器厂;HH-4 恒温水浴锅 国华电器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白酶的选择 蛋壳内膜质量分数5%，在各种酶最适温度和pH 下，分别添加一定量的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，对蛋壳内膜酶解2h 后，90℃灭酶15min，3000r/min 离心5min，取上清液测定各种酶解液的总抗氧化能力，选择酶解蛋壳内膜的最佳蛋白酶。

1.2.2 酶解工艺单因素实验 在100mL 的三角瓶中加入一定量的蛋壳内膜及中性蛋白酶，以总抗氧化能力为指标，分别改变酶解pH、酶底比(E/S)、酶解时间、酶解温度其中的一个因素，其他条件不变，进行单因素实验。

1.2.3 酶解工艺正交实验设计 蛋壳内膜质量分数5%，在单因素实验的基础上，选择pH、E/S、酶解时间、酶解温度四个因素，以总抗氧化能力为指标，进行正交实验设计。

1.2.4 总抗氧化能力的测定 参考文献［18］的方法，以总抗氧化能力(T-AOC)为指标进行考查。在10mL 具塞刻度比色管中加入1mL 样品溶液、1mL 3mol/L H2SO4溶液、1mL 0.028mol/L Na3PO4溶液和1mL 0.004mol/L(NH4)6Mo7O24溶液，加入蒸馏水定容至5.0mL，摇匀，置95℃水浴中加热反应，30min 后取出冷却至室温，以不加抗氧化剂体系为空白参比，测定695nm 波长下的吸光度。

1.2.5 对DPPH 自由基清除作用的测定 参考文献［19］的方法，将实验分为样品组、对照组和空白组。具体操作如下:在10mL 具塞试管中加入3mL DPPH有机溶液(0.1mmol/L，无水乙醇配制)，再加入0.5mL样品溶液，然后加入1mL 水充分混匀，静置30min 后在517nm 处测定吸光度。

清除率(%)=1-(A2-A1)/A0×100

其中，A2:3mL DPPH +0.5mL 样品溶液+1mL 水的吸光度;A1:3mL 乙醇+0.5mL 样品溶液+1mL 水的吸光度;A0:3mL 乙醇+1.5mL 水的吸光度。

1.2.6 对羟基自由基清除作用的测定 参考文献［20］的方法，略作改进。实验设样品组、空白组和对照组，样品组试管中依次加入PBS 缓冲液(pH7.4，0.4mol/L)、邻菲罗啉溶液(2.5mmol/L)、蛋壳内膜酶解液、硫酸亚铁溶液(2.5mmol/L)各1mL，H2O2溶液(20mmol/L)0.5mL;空白组中用1mL 去离子水代替样品溶液;对照组中用1.5mL 去离子水代替样品溶液和H2O2溶液。反应在37℃恒温水浴锅中进行，准确反应1h 后，快速记录536nm 处的吸光度。

清除率(%)=(A2-A1)/(A0-A1)×100

式中，A1:空白组吸光度;A2:样品组吸光度;A0:对照组吸光度。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的选择

底物浓度为5%，酶解时间2h，分别在中性蛋白酶，碱性蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶最佳的温度和pH 下，添加相同活力的酶，比较不同的蛋白酶对蛋壳膜酶解效果的影响。

以总抗氧化能力为指标，考察蛋壳内膜在不同蛋白酶作用后酶解液的抗氧化活性。由图1 可以看出，中性蛋白酶酶解蛋壳内膜的酶解液总抗氧化能力最强，碱性蛋白酶和胰蛋白酶酶解液总抗氧化能力相当，木瓜蛋白酶酶解液总抗氧化能力最弱。不同蛋白酶对蛋壳膜酶切位点不同，使酶解液中多肽、氨基酸、透明质酸、硫酸软骨素等的含量和比例不尽相同，所以抗氧化能力也有差别。中性蛋白酶酶解液吸光值随加酶量的增加呈上升趋势，并在酶底比为2000U/g 之后增加很快。所以本实验选择中性蛋白酶为酶解蛋壳膜的最佳用酶。

图1 不同蛋白酶对总抗氧化能力的影响Fig.1 Effect of different proteases on T-AOC

2.2 中性蛋白酶酶解蛋壳内膜单因素实验

2.2.1 pH 对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响酶解液pH 是决定酶活催化活性的重要参数之一，pH 过高或过低均对酶解反应产生不利影响。pH7既是蛋壳内膜水溶液的pH，也是中性蛋白酶酶解的最佳pH。从图2 可知，用中性蛋白酶酶解蛋壳内膜，当pH 为7 时，酶解液的吸光度最大，该条件下总抗氧化能力最强。

2.2.2 酶底比对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响 中性蛋白酶的酶解对象主要是蛋白质，经测定，所购原料蛋壳内膜粗蛋白的含量为58.63%，酶底比的选择范围参考文献［21-23］。从图3 中可知，底物浓度不变，改变加酶量，蛋壳内膜酶解液的总抗氧化能力变化不大，说明酶底比变化范围在6000 ～18000U/g 时，酶对底物的酶解效果是充分的。当酶底比为14000U/g 时，吸光度较低，可能是因为在酶比较充分的情况下，会将蛋壳膜酶解成一些不具有抗氧化活性的物质。因此，从经济角度考虑，选择的最佳酶底比为10000U/g。

表1 正交实验结果Table1 The results of orthogonal design

图2 pH 对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响Fig.2 Effect of pH value on T-AOC

图3 酶底比对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响Fig.3 Effect of E/S on T-AOC

2.2.3 时间对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响 从图4 可知，酶解时间3.5h 时，蛋壳内膜的中性蛋白酶酶解液的总抗氧化能力最强，在2.5h 及3h 时，总抗氧化能力有所下降，可能是在酶解过程中，蛋壳膜被酶解成一些不具有抗氧化活性的小分子物质。因此，选择最佳酶解时间为3.5h。

2.2.4 温度对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响 从图5 可知，当蛋壳膜酶解温度在35～55℃时，总抗氧化能力不断提高，超过55℃，总抗氧化能力又呈降低趋势。蛋白酶分子肽键具有特定的空间结构，酶解温度决定了蛋白酶分子的稳定性，若反应温度超过某一限度，极易引起次级键解离，致使蛋白酶丧失催化活性;当反应温度过低时，体系内分子运动的激烈程度大大降低，又降低了蛋白酶与底物碰撞的几率。温度过高或过低都不适合蛋壳膜酶解［24］。因此55℃是中性蛋白酶酶解蛋壳膜的最适温度。

图4 酶解时间对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of hydrolysis time on T-AOC

图5 温度对蛋壳内膜酶解液总抗氧化能力的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on T-AOC

2.3 中性蛋白酶酶解蛋壳内膜的最佳工艺条件及其酶解液的抗氧化活性

2.3.1 中性蛋白酶酶解蛋壳内膜正交实验最佳工艺条件的确定 由表1 及表2 可知，各因素对中性蛋白酶酶解效果的影响依次是:酶底比、温度、时间、pH，从而选出反应的最佳条件组合式:A1B2C3D1，即酶解时间3.0h，温度55℃，酶底比12000U/g，pH6.0。根据正交实验的结果，对最佳实验组合A1B2C3D1与原实验组合A2B2C3D1分别做三次总抗氧能力的重复实验，最佳组合A1B2C3D1总抗氧化均值为1.598 ±0.131，原实验组合A2B2C3D1总抗氧化均值为1.180±0.109，得出结论:最佳组合A1B2C3D1具有更高的抗氧化能力。

表2 正交实验方差分析Table 2 The analysis of variance by orthogonal design

2.3.2 蛋壳膜中性蛋白酶酶解液的总抗氧化能力 比较A1B2C3D1酶解液和0.1mol/L VC分别与磷钼酸反应后的吸光度大小来评价其总抗氧化能力大小。蛋壳内膜在中性蛋白酶最佳工艺条件下酶解液的总抗氧化能力值为1.598 ±0.131，0.1mol/L VC的总抗氧化能力的值为1.598 ±0.057，两者的总抗氧化能力相当。

2.3.3 蛋壳膜中性蛋白酶酶解液对DPPH 自由基的清除作用 二苯代苦味酰基自由基(即DPPH 自由基)是一种稳定存在的有机自由基，若受试物能清除它，则表示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基的有效浓度，打断脂质过氧化链反应的作用［25］。其单电子在515nm 附近有强的吸收，其乙醇溶液呈现紫色;如果有其他物质提供1 个电子与此单电子配对，吸收将会消失，溶液被还原为浅黄色，通过测定反应体系在515nm 附近吸收峰下降程度可以直接评价试样抗氧化活性的强弱。根据正交实验的结果，研究蛋壳膜在中性蛋白酶最佳工艺条件A1B2C3D1的酶解液对DPPH 自由基的清除作用，并与0.1mol/L VC对DPPH 自由基的清除作用进行比较。A1B2C3D1组合对DPPH 自由基的清除能力为91.13% ±2.80%，0.1mol/L VC对DPPH 自由基的清除能力为98.68% ±0.40%，酶解液的DPPH 自由基清除能力略低于VC。

2.3.4 蛋壳内膜中性蛋白酶酶解液对羟基自由基的清除作用 羟基自由基是已知最活泼的活性氧自由基，也是危害最大的氧自由基，它可以与活细胞中的任何分子发生反应而造成损害，而且反应速度极快，尤其是羟基自由基可直接引发DNA 链的损伤，如DNA 断裂、DNA 之间的交换、DNA 染色体畸变等，而这种损伤是癌症启动和促进的基础［26］。蛋壳膜在中性蛋白酶最佳工艺条件A1B2C3D1的酶解液对羟基自由基的清除能力为83.67% ±6.21%，0.1mol/L VC对羟基自由基的清除能力为83.67% ±4.68%，酶解液与VC清除羟基自由基的能力相当。

3 结论

蛋壳内膜经蛋白酶酶解后具有一定的抗氧化活性。中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶作用于蛋壳内膜得到的酶解液表现出不同的抗氧化活性，且中性蛋白酶酶解液的抗氧化效果优于其他三种酶。通过正交实验，得到中性蛋白酶酶解蛋壳膜的最佳工艺条件为A1B2C3D1即蛋壳内膜质量分数5%，pH6.0，酶底比12000U/g，酶解温度55℃，酶解时间3.0h，蛋壳内膜酶解液的总抗氧化能力最强。用此酶解液与0.1mol/L VC做比较，得知酶解液对DPPH 自由基，羟基自由基清除率，总抗氧化能力，都有较好的效果。蛋壳膜来源安全，具有优良的抗氧化性，在保健食品等方面有很大的开发潜力。

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