花生红衣总多酚抑制酪氨酸酶活性和抗氧化作用研究

曹伟伟，朱晓娜，李明静，2，*

(1.河南大学化学化工学院，河南开封475004;2.河南大学，河南省天然药物与免疫工程重点实验室，河南开封475004)

现代医学研究证明，衰老、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有着直接的关系［1］。天然抗氧化剂有抑制体内脂质过氧化和清除自由基的作用，同时可促进体内抗氧化酶与内源性抗氧化剂的合成［2］，因此得到普遍关注，将会大量应用于食品及保健品的生产中［3］。花生红衣中富含多酚类物质，具有抗氧化、抗自由基等生物活性［4］。但在花生加工过程中，花生红衣仍然作为一种经济效益较低的副产品，并没有得到合理的开发利用［5］。据文献报道提取多酚类物质的方法如加热回流方法［6］具有耗时长，溶剂浪费严重，多酚物质容易分解等缺点。闪式提取技术具有溶剂用量小、提取时间短和操作简单等优点，是一种高效、节能的新型提取技术［7］，特别适合热敏性物质的提取。闪式提取已广泛应用于植物中的有效成分的提取，并取得了良好的效果。酪氨酸酶是生物合成黑色素细胞的主要限速酶，抑制酪氨酸酶的活性，可改善皮肤色素细胞中酪氨酸酶的代谢，阻止色素沉着，达到美白效果［8］。目前发现市场上许多化妆品中抑制酪氨酸酶活性的化学合成物质存在安全问题，天然植物提取物具有无毒、安全等特点，因此，天然植物类化妆品的开发研究越来越受到国内外广大消费者的青睐。本文拟用闪式提取技术对花生红衣多酚类物质的提取工艺进行优化，并对花生红衣总多酚对酪氨酸酶活性的抑制作用及抗氧化活性进行测定，旨在为花生红衣的综合开发利用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

没食子酸标准品 上海市化工学校化工厂;Folin-Ciocalteu 试剂［9］:称取5.00g 钼酸钠(NaMoO4)和20.00g 钨酸钠(NaWO4)于250mL 圆底烧瓶中，加入150mL 蒸馏水，10mL 85%的磷酸和20.0mL 浓盐酸，冷凝回流10h，冷却后，取下冷凝管，加入30.00g硫酸锂(Li2SO4)和15.0mL 双氧水(H2O2)，加热沸腾20min 至亮黄色，冷却后用蒸馏水定容于500mL 棕色容量瓶，于4℃冰箱里保存备用;酪氨酸酶(965U/mg)、3，4-二羟基苯氨酸(L-DOPA) 购于上海宝曼生物科技有限公司;1，1-二苯基苦肼基自由基(DPPH 自由基) 日本化成工业株式会;无水乙醇、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、Li2SO4、NaMoO4、NaWO4等试剂 均为国产分析纯;蒸馏水。

花生红衣 花生采于河南开封近郊，40℃干燥2h，然后60℃干燥2h，手工去皮，备用。

LabTech UV - BlueStar 紫外/可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司;JHBE-50S 闪式提取器 河南金鼐科技发展有限公司;Martin Christ Alphal-2 冷冻干燥机 German;DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司;PHS-P1酸度计 上海大普仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线的绘制 采用福林-酚比色法［10］:精确称取没食子酸对照品0.0100g，用蒸馏水溶解并定容于250mL 的容量瓶中，得浓度为40μg/mL 的没食子酸标准品溶液。分别取体积为0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL 的没食子酸标准品溶液于10mL 比色管中，依次加入3.00mL 蒸馏水，1.50mL Folin - Ciocalteu 试剂，3.00mL 饱和Na2CO3溶液，定容，在30℃恒温水浴锅中保温30min。冷却至室温后在760nm 处测定吸光度。以没食子酸对照液浓度x(μg/mL)为横坐标，以吸光度Y 为纵坐标，得回归方程为Y =0.1803x +0.014，R =0.9990。

1.2.2 花生红衣总多酚的提取及含量测定 称取干燥的花生红衣粉末2.0000g(n =3)，用40mL 浓度为80%的乙醇溶液超声提取，功率400W，提取30min，提取6 次，至提取液无色，合并提取液，蒸至醇干，用蒸馏水定容于100mL 容量瓶，作为总多酚提取液备用。

花生红衣总多酚的含量，即超声提取所得总多酚的量与样品质量的比值:

花生红衣总多酚的含量(%)= 所得总多酚的量/样品的质量×100

精确吸取总多酚提取液1.00mL，用蒸馏水稀释至50mL 容量瓶中。取上述稀释液，按1.2.1 标准曲线的绘制方法操作，在760nm 处测定吸光度并计算得花生红衣中总多酚的含量为17.40%，17.74%，16.82%，平均值为17.32%(RSD =3.25%，n =3)。

1.2.3 总多酚提取率计算公式 花生红衣总多酚的提取率，即闪式提取所得花生红衣总多酚的量与所用样品中总多酚量的比值:

总多酚提取率(%)= 闪式提取得到的总多酚量/所用样品中总多酚量×100

1.2.4 闪式提取条件的选择 分别考察乙醇浓度、料液比和提取电压对花生红衣中总多酚提取率的影响，在单因素实验的基础上考察总多酚提取率，然后采用正交实验法优化得最佳工艺条件。

1.2.4.1 乙醇浓度的选择 准确称取9 份粉碎的花生红衣样品各2.0000g，固定提取时间2min，提取电压90V，分别加入40mL 体积分数分别为0%、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液进行闪式提取，将提取液减压抽滤定容于100mL 容量瓶中，取一定体积溶液按照1.2.2 步骤测定，按照

1.2.3 的公式计算总多酚提取率。

1.2.4.2 料液比的选择 准确称取5 份粉碎的花生红衣样品各2.0000g，固定提取时间2min，提取电压90V，分别加入20、30、40、50、60mL 80%的乙醇溶液进行闪式提取，将提取液减压抽滤定容于100mL 容量瓶中，取一定体积溶液按照1.2.2 步骤测定，按照

1.2.3 的公式计算总多酚提取率。

1.2.4.3 提取电压的选择 准确称取5 份粉碎的花生红衣样品各2.0000g，固定提取时间2min，分别加入40mL 80%的乙醇溶液，控制提取电压分别为80、85、90、95、100V 进行闪式提取，将提取液减压抽滤定容于100mL 容量瓶中，取一定体积溶液按照1.2.2 步骤测定，按照1.2.3 的公式计算总多酚提取率。

1.2.4.4 提取次数的选择 准确称取4 份粉碎的花生红衣样品各2.0000g，固定提取时间2min，提取电压90V，分别加入40mL 80%的乙醇溶液进行闪式提取，考察提取1、2、3、4 次总多酚提取率，将提取液减压抽滤定容于100mL 容量瓶中，取一定体积溶液按照1.2.2 步骤测定，按照1.2.3 的公式计算总多酚提取率。

1.2.4.5 最佳工艺条件的选择 为了得到闪式提取花生红衣总多酚的最佳工艺条件，通过对乙醇浓度、料液比和提取电压进行正交实验分析，确定三因素三水平L9(33)(表1)实验，探究闪式提取花生红衣总多酚的最佳工艺条件。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factor and coded levels in the orthogonal array design

1.2.5 测定溶液的配制 0.010mol/L 多巴溶液的配制:准确称取0.3900g 多巴，用蒸馏水溶解并定容至200mL 容量瓶中，将配好的溶液用锡纸包好避光，备用。

0.10mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH =6.5)的配制:量取68.5mL 0.2mol/L 的磷酸二氢钾和31.5mL 0.2mol/L三水合磷酸氢二钾溶液，用蒸馏水定容至200mL，备用。

50U/mL 酪氨酸酶溶液的配制:准确称取5.2mg 965U/mg 的酪氨酸酶，用蒸馏水溶解定容至100mL容量瓶中，将配好的溶液置于黑暗处避光存放，备用。

将花生红衣总多酚提取物、维生素C 和没食子酸(GA)标准品分别配制成质量浓度为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。将DPPH·配成质量浓度为1.0mg/mL的无水乙醇溶液。

1.2.6 提取物对酪氨酸酶活性的抑制率计算［11-12］按照如下公式计算花生红衣总多酚对酪氨酸酶的抑制率:

式中，A1是加酪氨酸酶，不加提取液，加多巴溶液时的吸光度;A2是加酪氨酸酶，不加提取液，不加多巴溶液时的吸光度;A3是加酪氨酸酶，加提取液，加多巴溶液时的吸光度;A4是加酪氨酸酶，加提取液，不加多巴溶液时的吸光度。

1.2.7 清除DPPH·的计算［13］根据公式计算清除率:

清除率(%)=［1-(Ai-Aj)/A0］×100

式中，Ai:样液与DPPH·溶液混合后在最大吸收波长处的吸光度值;Aj是样液与无水乙醇混合后在最大吸收波长处的吸光度值;A0是DPPH·在最大吸收波长处的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 花生红衣总多酚闪式提取工艺

2.1.1 单因素实验

2.1.1.1 乙醇浓度对花生红衣提取液中总多酚含量的影响 固定提取时间2min，料液比1∶20，提取电压90V，称取花生红衣粉末各2.0000g，分别用0%、20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液提取。结果如图1 所示，随着乙醇浓度的增大，总多酚提取率不断提高，当乙醇浓度达到80%时，花生红衣总多酚的提取率最高，这与花生红衣总多酚提取液中，多酚类物质的极性有关。故在正交实验中选择乙醇浓度为70%、80%、90%进行正交实验考察。

图1 乙醇浓度对总多酚提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols extraction fficiency

2.1.1.2 料液比对花生红衣提取液中总多酚含量的影响 固定提取时间2min，乙醇浓度为80%，提取电压90V，称取花生红衣粉末各2.0000g，分别用1∶10、1∶15、1∶20、1∶15、1∶30 的料液比提取。结果如图2 所示，花生红衣总多酚的提取率随着料液比的增大而提高，当料液比达到1∶20 以后，花生红衣总多酚的提取率趋于稳定。这与提取液体积增大，蒸发浓缩的能耗等会相应增大，综合考虑各个因素，故选择料液比为1∶15、1∶20、1∶25 进行正交实验考察。

图2 料液比对总多酚提取率的影响Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of polyphenols extraction efficiency

2.1.1.3 提取电压对花生红衣提取液中总多酚含量的影响 固定提取时间为2min，乙醇浓度为80%，料液比1∶20，称取花生红衣粉末各2.0000g，分别用80、85、90、95、100V 的电压提取。结果如图3 所示，花生红衣总多酚的提取率随提高电压的增大而增高，当电压达到90V 时，提取率达到最大，而电压大于90V时，总多酚提取率略微降低。可能由于随着功率的增大，闪式提取器的刀头转速加大，产生热量，使多酚类物质发生氧化或分解，导致总多酚的提取率有所降低。故选择提取电压为85、90、95V 进行正交实验考察。

图3 提取电压对总多酚提取率的影响Fig.3 Effect of voltage on the yield of polyphenols extraction efficiency

2.1.1.4 提取次数对花生红衣提取液中总多酚含量的影响 固定提取时间2min，乙醇浓度为80%，料液比1 ∶20，提取功率90V，称取花生红衣粉末各2.0000g，对花生红衣进行1、2、3、4 次提取。结果如图4 所示，随着提取次数的增加，花生红衣总多酚提取率依次增加，提取3 次以后，提取率增加平缓，故选择提取次数为3 次。

2.1.2 正交实验设计及结果分析 根据单因素实验结果，采用正交实验进一步优化闪式提取花生红衣总多酚的工艺条件。每次花生红衣粉末用量为2.0000g，采用L9(33)正交因素水平表(见表1)，设计L9(33)正交实验(表2)进行提取。

图4 提取次数对总多酚提取率的影响Fig.3 Effect of Extraction times on the yield of polyphenols extraction efficiency

实验结果如表2 和表3 所示，影响花生红衣总多酚提取率的因素顺序为B ＞A ＞C，即料液比＞乙醇浓度＞提取电压。综合考虑确定最佳提取条件为A2B3C2，即乙醇浓度为80%，料液比为1∶25，提取电压90V。在最佳提取条件下，提取3 次，花生红衣总多酚平均提取率为96.94%，RSD =2.06%，(n =3)。

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

2.2 花生红衣总多酚对酪氨酸酶活性的影响

35℃恒温条件下，向10mL 比色管中加入2.0mL酪氨酸酶溶液，3.5mL 的磷酸盐缓冲液，再分别加入总多酚浓度为3.464mg/mL 的溶液0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0、1.5、2.5mL，最后加入2.0mL 多巴，定容，恒温2min，在475nm 处测定吸光度，按1.2.6 的方法计算花生红衣总多酚对酪氨酸酶的抑制率。

结果表明，花生红衣总多酚对酪氨酸酶有较好的抑制作用，并且随着总多酚浓度的增大，抑制率随之增大，当总多酚增大到一定浓度时抑制率增大平缓，抑制率达到50%的总多酚的质量浓度(IC50)为0.451mg/mL。

图5 花生红衣总多酚对酪氨酸酶的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of Polyphenols from Peanut Testa on activity of tyrosinase

2.3 花生红衣总多酚对DPPH·清除能力的测定

DPPH·是一种人工合成的稳定自由基，其乙醇溶液显紫色，在517nm 处有最大吸收。以无水乙醇为对照，精确吸取1.0mL DPPH·溶液与1.0mL 无水乙醇于10mL 比色管中，定容，摇匀后放置30min，测定上述溶液在最大吸收波长下的吸光度A0。精确吸取体积为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL 样液，加入1.0mg/mL 的DPPH·溶液1.0mL，定容，摇匀后放置30min，测定上述溶液在最大吸收波长下的吸光度得Ai值，同理可测得Aj值，按照1.2.7 的方法计算清除率。

由图6 可知，VC、没食子酸、花生红衣总多酚均具有较好的清除DPPH·的作用，清除率达到50%的质量浓度分别为10.26、3.68、4.61μg/mL。结果表明花生红衣总多酚清除DPPH·的能力大于VC，稍弱于没食子酸。

图6 不同抗氧化剂对DPPH 自由基的清除活性Fig.6 Scavenging rates of different antioxidants on DPPH free radicals

3 结论

3.1 通过单因素实验和正交实验得闪式提取最佳工艺条件为乙醇浓度为80%，料液比为1∶25，提取电压为90V，影响因素大小顺序为料液比＞乙醇浓度＞提取电压。该工艺具有提取时间短、提取效率高、安全可靠等优点。

3.2 花生红衣总多酚具有较好的抑制酪氨酸酶活性的作用，IC50为0.451mg/mL;具有较强的清除DPPH·的能力，抗氧化强弱顺序为没食子酸＞花生红衣总多酚＞VC。因此，花生红衣总多酚在化妆品、食品及保健品等领域具有潜在的应用价值。

［1］方允中，郑荣梁.自由基生物学的理论与应用［M］.北京:科学出版社，2002:1-58.

［2］谭萍，方玉梅，王毅红，等.苦荞种子黄酮类化合物清除DPPH 自由基的作用［J］.食品研究与开发，2008，(12):20-23.

［3］陆艳丽，管毓相，方玉梅，等.千里光黄酮类化合物清除DPPH 自由基的作用［J］.食品科技，2010:35(3):197-199.

［4］刘大川，刘强，吴波，等.花生红衣中自藜芦醇、原花色素提取工艺研究［J］.食品科学，2005，26(7):144-148.

［5］Jiangmei Yu，Mohamed Ahmendna，Ipek Goktepe.Effects of processing methods and extraction solvents on concentration and antioxidant activity of peanut skin phenolics［J］.Food Chemistry，2005(90):199-206.

［6］姚永志，左锦静，王子涵.乙醇提取花生红衣多酚物质的研究［J］.中国油脂，2007(3):51-53.

［7］吴冬梅.闪式提取器在中药研究中的应用［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12(7):34-37.

［8］傅博强，李欢，王小如，等.甘草黄酮类化合物对酪氨酸酶单酚酶的抑制［J］.天然产物研究与开发，2005，17(4):391-395.

［9］王宏.苹果渣中多酚物质的提取、分离及其抗氧化活性研究［D］.西安:陕西师范大学，2006:16-17.

［10］凌关庭.抗氧化食品与健康［M］.北京:化学工业出版社，2004:342-343.

［11］潘维，罗增锋，刘锦梅.槐豆黄酮提取物对酪氨酸酶活性抑制作用的研究［J］.现代农业科学，2008，15(8):12-16.

［12］王庆华，邓志刚，刘山，等.荔枝壳提取物对酪氨酸酶的抑制作用［J］.日用化学工业，2010，40(1):31-34.

［13］熊双丽，李安林，任飞，等.苦荞和甜荞麦粉及麦壳中总黄酮的提取和自由基清除活性［J］.食品科学，2009，30(3):118-122.