糖基化修饰产物的抗氧化功能研究进展

鲁 倩，林亲录，吴 伟，高 宇，方婧杰，梁 盈，2，*

(1.中南林业科技大学，稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南长沙410004;2.华南理工大学，淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心，广东广州510630)

随着蛋白质组学［1］的深入研究，急迫需要具有优良功能的蛋白质作为食品原料，而蛋白质通过改性可以使其功能性质得到更好的发挥。蛋白质的糖基化［2］是重要的翻译后修饰，它调控着生物体的生命活动，超过50%的细胞会被修饰成具有独特生物活性的糖蛋白。这些糖蛋白［3］在各自的体系中发挥着与生物免疫、抗病毒、抗氧化等密切联系的功能。鉴于糖基化作用与人类的一些疾病(糖尿病、心血管病、白内障等)及衰老的关系［4］，扩大了蛋白质在医学及营养学领域的用途。蛋白质的糖基化修饰，实质就是美拉德反应，整个过程都是自发的，这给天然抗氧化剂的寻找和应用开辟了新道路［5］。自由基［6］是人体的中间代谢产物，通常在体内处于动态平衡，不表现出对组织、细胞功能的损伤。然而，随着年龄增长、环境污染、辐射等各种因素将导致体内自由基过剩，进而破坏正常细胞，引起癌症、动脉硬化、高血压等各种疾病。抗氧化剂(如BHA、BHT［7］)能有效清除自由基，抑制或减缓氧化反应，但有研究表明这些物质可能对人体健康有一定的不良影响，因此寻找一种新型抗氧化剂对食品工业是至关重要的。目前，已有不少学者主张通过美拉德反应［8］制备产物(MRPs)加入食品体系，从而提高产品抗氧化稳定性［9］，并且它作为一种“绿色”食品添加剂，符合现代社会对食品的要求。

1 糖基化修饰

蛋白质糖基化是指在肽链生物合成的同时或合成后，在酶的催化作用下，将糖链连接到肽链上特定糖基化［10］位点的过程。糖基化修饰按糖肽链的不同进行分类。

1.1 N-糖基化

通常指糖链共价连接在蛋白质的天冬酰胺(Asn)的氨基酸侧链处，糖链与Asn 残基的连接发生在三个残基的特殊识别序列(Asn-X-Ser/Thr，其中X 为除Pro 和Asp 以外的任何氨基酸)处。N-糖链［11］分为三种:高甘露糖型、复杂型和混合型。所有的N-糖链都有一个相同的五糖核心结构，由2 个N-乙酰葡萄糖胺连接3 个甘露糖组成。这类糖基化修饰有N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶参与完成。在该酶作用下，将供体UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的GlcNAc 转移到甘露糖。

1.2 O-糖基化

一般指多糖与丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、羟赖氨酸、羟脯氨酸残基上的羟基氧连接形成的，其糖链多数为N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖。O-糖基化［12］没有一种确定的核心结构，最常见的是由N-乙酰半乳糖胺与丝氨酸或苏氨酸残基的羟基氧连接，再加上不同数量的单糖分子延伸而成。

1.3 C-糖基化

C-糖基化是由甘露吡喃糖基与色氨酸吲哚环的C2通过C-C 键连接而成。这种修饰需要特定的氨基酸模序Trp-X-X-Trp、Trp-X-X-Cys、Trp-X-XPhe，X 为任意氨基酸，修饰位置都是第一位的色氨基酸残基，这种糖基化修饰比较少见。

由此可见，国内外对糖基化的研究主要集中在N-糖基化和O-糖基化，主要利用不同的糖基供体来使反应进行的更顺利。因此，通过研究具体的修饰过程进而选择合理的糖基供体是实验的关键。

2 糖基化反应产物抗氧化机理

糖基化反应产物主要有类黑精、还原酮及一系列含N、S 杂环化合物。研究表明，这类物质有一定的抗氧化性，其中某些物质的抗氧化强度可以与食品中常用抗氧化剂相媲美［13］。

2.1 类黑精

由于美拉德中间产物的高反应活性和复杂的聚合作用和脱水作用的发生，就形成了褐色的类黑精［14］。主要有三种结构的类黑精［15］:蛋白质与低分子量着色化合物交联产生的以蛋白质为基本成分的类黑精;由呋喃或吡咯重复单元组成的类黑精聚合物;醇醛缩合形成糖降解产物中的以碳水化合物为基础的类黑精。

最近，国内外对类黑精物质的抗菌和抗氧化作用进行了大量研究。据日本媒体报道，类黑精作为非消化性高分子化合物存在于消化器官中，发挥着类似食物纤维素的生理机能，不但促进血清胆固醇降低，还可以使肠道内乳酸菌素增值。师成斌、张晓云［16］等从黑麦芽中提取出类黑精(MBM)，并测定其还原力和对DPPH·的清除率。结果表明:MBM 的还原力和对DPPH·的清除能力都达到了较高水平，证明黑麦芽类黑精具有较强的抗氧化性，具有开发保健型啤酒和天然抗氧化剂的潜力。王亚君［17］等发现丙烯酰胺与类黑精生成量相关，在食品的热加工过程中，天门冬酰胺和还原糖会发生反应生成具有神经和遗传毒性及致癌性的丙烯酰胺，同时还会生成具有显著抗氧化活性功能的类黑精类物质。加入外源性抗氧化剂(如维生素C、大蒜素等)可有效抑制丙烯酰胺的环氧化过程。类黑精类物质具有相同显著的抗氧化、抗诱变和消除活性氧等性能，其抗氧化强度可与食品中常用的抗氧化剂(如:BHA、BHT、维生素C 等)相媲美。

2.2 还原酮

美拉德反应的初始阶段，还原糖和氨基酸反应即可生成不稳定的氨基还原酮，参与系列反应，形成褐色物质，导致食品褐变。MRPs 中的还原酮具有还原和螯合作用，这能起到抗氧化的作用。

Gu［18］等研究了酪蛋白和葡萄糖反应得到的美拉德产物的抗氧化活性，结果表明反应所得的MRPs 分子质量越高，其表现出的还原能力和金属螯合活性越好。MRPs 中的还原酮提供氢原子进而打破自由基链式反应，还原酮可以与一些过氧化物的前体物反应阻止过氧化物的生成，从而达到抗氧化目的。

2.3 含N、S 杂环化合物

挥发性杂环化合物具有抗氧化性能，这类化合物主要是噻吩、噻唑、唑、呋喃和吡嗪等含S、N 的杂环化合物。

Osada［19］等从不同氨基酸和葡萄糖反应产生物中提取挥发性化合物，并测定不同浓度的挥发性化合物对己醛氧化的抑制率。结果表明浓度高于20μg·mL-1的挥发性化合物表现出对己醛氧化的抑制作用。这类物质具有的抗氧化性是由于具有芳香特性的五元和六元杂环化合物中6 个π 电子非定域分布于环上，使碳原子上电子过剩，由于碳原子上π电子云密度提高而有助于自由基亲电加成，起到抗氧化的效果。

在图1 五元和六元杂环化合物中，6 个π 电子非定域分布于环上，由于杂原子的存在，使π 电子密度分配不均。吡嗪中两个N 原子从四个C 原子上拉π电子以补充其不足，而呋喃、唑、噻吩的电子都分布在五个原子上，使C 原子上电子过剩。五元杂环化合物碳原子上π 电子密度有助于自由基的亲电加成，即表现出较强的抗氧化性能;而缺少π 电子的吡嗪不能进行亲电加成进而无抗氧化能力。

图1 五元和六元杂环化合物上π 电子密度Fig.1 The electron density of five and six-membered heterocyclic compounds

3 糖基化反应对产物抗氧化性能的影响

产物糖基化后其抗氧化活性会有所增加，一般是测定产物的体内和体外抗氧化活性。体内活性通常采用小鼠实验，而其体外活性一般是通过测定产物总还原能力，测定H2O2的清除效果，脂质体过氧化抑制能力，O2-、·OH、DPPH·及ABTS+自由基清除能力等来实现。鲁伟等人［20］将抗氧化性能用测定MRPs 清除DPPH·能力大小表示;马志玲等人［21］通过β-胡萝卜素-亚油酸模式体系以及亚油酸过氧化方法评价了MRPs 的抗氧化能力;王惠英等人［22］用流动注射化学发光法考察了美拉德反应产物对超氧阴离子自由基的清除活性。

表1 不同糖基化反应因素对产物抗氧化性能的影响Table 1 The impact of different factors on the product of oxidation resistance

糖基化反应，其实质是氨基酸与还原糖的反应，过程中需要考虑不同因素［23］对其反应产物抗氧化性能的影响，包括合适的pH，反应温度，反应时间，反应物浓度，以及不同种类的还原糖和氨基酸等，表1总结了近几年研究者们获得较强抗氧化能力产物时的不同影响因素。

4 糖基化反应产物抗氧化活性研究

4.1 产物体外抗氧化活性研究

早在1953 年，Hodge 和Rist［30］就首先报道了有关MRPs 具有防止植物油氧化的效果。Frnazke 和Ivainsky［31］在1954 年也注意到MRPs 具有抗氧化性，初步研究了向人造奶油中添加甘氨酸-葡萄糖反应产物可提高人造奶油的氧化稳定性。万素英等［32］报道在弱酸性(pH=5～7)条件下，木糖-赖氨酸MRPs 的抗氧化活性较木糖-甘氨酸MRPs 的抗氧化活性高。有报道显示，木糖与甘氨酸、木糖与赖氨酸、木糖与色氨酸、二羟基丙酮与组氨酸、二羟基丙酮与色氨酸、壳聚糖和葡萄糖的氧化产物有很好的抗氧化作用。

4.2 产物体内抗氧化活性研究

为了将糖基化产物的抗氧化应用到人体中，必须通过小鼠进行一系列研究。田甜等人［33］选取健康小鼠随机分组，分组每日定时灌胃覆盆子糖蛋白粗提物并饲喂，在末次灌胃后禁食12h，摘除眼球进行眼眶采血，迅速解剖取出肝、脑、肾、胸腺、脾、心脏等脏器，冷冻备用，并制备血清和组织匀浆将上清液倾入洁净试管低温保存备用，通过测定小鼠血清、肝脏、脑组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的变化，研究覆盆子糖蛋白粗提物对小鼠体内抗氧化性的影响。结果表明:覆盆子糖蛋白粗提物可显著增强小鼠血清、肝脏、脑组织中CAT、SOD、GSH-Px活性。

4.3 生物学水平抗氧化活性的研究

从生物学水平研究糖基化产物的抗氧化活性扩大了其在医学领域的应用。张瑛等人［34］通过动物细胞研究AGE(晚期糖基化终产物)证实AGE 修饰的血清白蛋白显著促进动脉粥样斑块的形成，斑块部位血管内膜下的炎症细胞浸润显著增强。这些结果提示AGE 修饰蛋白可能参与了动脉粥样硬化发展过程中的急性炎症阶段，促进白细胞通过血管内皮屏障迁移至内膜下。廖剑等人［35］应用基于小扁豆凝集素亲和的糖蛋白质组学技术，分析和鉴定肝癌血清中岩藻糖基化异常的糖蛋白质组，并验证其诊断肝癌的潜能。

4.4 抗氧化产物在食品领域中的应用

通过美拉德反应制得的产物已大量应用到食品工业的实际生产中。于汐洋等人［36］利用膜分离手段考察咸味香精中的肉味香基以及不同分子量的MRPs 对卵磷脂脂质体的抗氧化效果。结果表明，肉味香基对脂质体过氧化有抑制能力，其抗氧化能力随反应物浓度的增加而增强。陈黎洪等人［37］分析金华火腿副产品酶解物的组成，通过与葡萄糖、木糖进行反应制MRPs，经体外实验评定MRPs 的抗氧化活性，随反应时间延长，金华火腿副产品酶解物的MRPs 颜色不断加深，DPPH·清除率与还原力均呈上升趋势。张陆霞等人［38］用复合蛋白酶水解鳕鱼排来抽提鱼肉骨蛋白，利用获得的可溶性蛋白与木糖、葡萄糖、混合糖制备美拉德反应产物，测定其还原能力和清除DPPH·能力。实验证明:鳕鱼排水解蛋白美拉德反应产物是一种具有较强抗氧化性的营养风味型食品添加剂。

5 展望

近年来，糖基化反应被广泛应用到食品加工中，尤其是对大豆蛋白，大米蛋白，乳清蛋白的修饰。我们课题组［39］已经对糖基化修饰大米蛋白对其功能性质的影响做了大量研究，实验证明通过一系列改性条件的优化，新合成的糖蛋白的溶解性、乳化性、热稳定性、抗菌性和抗氧化性等功能性质得到了极大改善，尤其是限制大米蛋白进一步加工利用的溶解性得到了显著的提高。而糖基化修饰对产物抗氧化性能的提升，不仅能有效清除人体中过剩的自由基达到抗衰老作用，也能进一步延缓血管和组织的老化，对心脑血管疾病的保健发挥一定的作用，所以无论在食品工业或是保健行业中都有着巨大的开发利用前景。

国内外对于糖基化修饰，都集中在其反应机理的研究，而对于如何通过修饰使其功能性质在食品领域中得到充分应用则是我们应该专注的问题。目前在食品加工业中有很多优良的蛋白急需开发，比如以低敏性闻名而适合婴幼儿食用的大米蛋白，具有高生物价、高营养性能的乳清蛋白等。我们应运用一系列优化工艺，不仅使其营养性质得到保存，还要在实际生产中提高其抗氧化活性，进而扩大各种蛋白质在各领域中的应用。

当然，对于抗氧化活性［40-41］的研究中，如何选择合适的糖基供体优化其抗氧化性能，并以其自然的，无害的产物来代替合成的抗氧化剂也是今后的研究重点。有研究已发现南瓜多糖具有优良的抗氧化性［42］，如何将其应用到实际中去修饰各种蛋白，进而提高抗氧化活性有待进一步研究。

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