绿豆胰蛋白酶抑制剂的含量、多型性及稳定性

江均平，李春红，张 涛，云冬梅，杨雪丰

(1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193；2.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；3.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206)

胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一类物质，广泛存在于动物、植物和微生物中，在体内能与相应的胰蛋白酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命活动，在生物的生理体系中发挥重要作用。临床上TI对溃疡性结肠炎[1]、辐射损伤[2-3]、HIV和肿瘤[4-6]等有一定的疗效；农业上可以用于病虫害防治；食品工业上用来抑制蛋白酶，防止香肠、肉丸、低盐鱼产品、海洋蓝鲹鱼糜凝胶软化[7-8]，改善肉类食品的质构。

但是TI是一种抗营养因子，抑制消化道胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，降低蛋白质的消化。另外，TI与肠内胰蛋白酶结合后随粪便排出体外，使肠内胰蛋白酶数量减少，引起胰腺反射性亢进，分泌量加大，同时肠促胰酶肽分泌也增加，这种双重的过分刺激胰腺分泌，势必造成胰腺分泌失调性肥大和增生[9]。胰蛋白酶中含有丰富的含硫氨基酸，体内胰蛋白酶的流失会造成体内含硫氨基酸的内源性散失，致使体内氨基酸代谢失调或不平衡。

绿豆(Vigna radiata(L.) R. Wilczek)原产于中国，已有2000多年的栽培史，印度、缅甸、朝鲜、日本等国均有栽培，在人们生活中占有十分重要的地位。绿豆中含有一定量的TI，其比活力是大豆TI的2.76倍[10]，而且耐热、耐酸[11]，但目前缺乏大面积栽种品种TI含量、多型性及稳定性的基础数据，这些数据对绿豆TI资源的开发利用以及科学食用绿豆都有参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿豆品种26份，来自我国主产区，品种名称和产地见表1；红豆品种：辽引红豆(产地辽宁沈阳)、京农21、XD1(产地吉林白城)；黑豆品种：绥03-3772(产地黑龙江齐齐哈尔)、成都安德公司小粒黑豆、中农绿谷公司小粒黑豆。

苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐(BAPNA) 美国Sigma公司；胰蛋白酶(1：250)(酶活力＞250NFU/mg) 美国Bio Basic公司；明胶为化学纯。

1.2 仪器与设备

1093 CYCLOTEC旋风磨 瑞典Foss公司；UV-752型紫外-可见分光光度计 上海元析公司；TU-20DTEMPUN IT精密恒温水浴锅 英国Techne公司；DYY-8C电泳仪 北京六一公司。

1.3 酶的提取

绿豆用旋风磨磨成8 0 目，置于冰箱备用。取1000.0mg绿豆粉用20mL蒸馏水于150mL三角瓶中180r/min振荡提取1h(37℃)，12000r/min离心10min得提取液。

1.4 胰蛋白酶抑制剂活性测定

1.4.1 测定原理

参照文献[12-13]进行。胰蛋白酶可催化水解BAPNA，引起410nm波长处吸光度增加，而胰蛋白酶抑制剂加入上述体系后，抑制了胰蛋白酶的活性，使410nm波长处吸光度增加的幅度有所减少，以其减少程度表示此抑制剂的抑制能力，从而计算出抑制活性。

1.4.2 溶液配制

Tris-HCl缓冲液：0.294g CaCl2·H2O用100mL 0.05mol/L、pH8.2 Tris-HCl缓冲液溶解；BAPNA溶液：20.0mg BAPNA先用0.5mL二甲基亚砜溶解，再用37℃的Tris-HCl缓冲液定容至50mL；胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶40mg先用2mL 1mmol/L盐酸溶解，再用蒸馏水定容至50mL。

1.4.3 指标测定

1.4.3.1 胰蛋白酶活性测定

Tris-HCl缓冲液0.5mL、提取剂(dH2O)0.2mL、胰蛋白酶溶液0.2mL，37℃保温5min后，加入BAPNA溶液0.5mL，保温10min后加入乙酸0.2mL，混匀，以空白对照(即在进行反应时最后加酶液)作参比，测定410nm波长处的吸光度(AT)。

1.4.3.2 蛋白酶抑制剂活性测定

Tris-HCl缓冲液0.5mL、TI溶液0.2mL、胰蛋白酶溶液0.2mL，37℃保温5min后，加入BAPNA溶液0.5mL，保温10min后加入30%乙酸0.2mL，混匀，以空白对照(在进行反应时最后加酶液)作参比，测定410nm波长处的吸光度(ATI)。

1.4.3.3 计算方法

抑制剂活性单位定义为：在上述反应条件下抑制1mg 1：250的胰蛋白酶活性所需要的抑制剂量为1个单位(TIU)。

1.5 高温对抑制剂稳定性的影响

取0.5mL提取液于带螺旋盖的菌种冷冻管中，加入0.5mL蒸馏水，拧紧盖子，于100℃水中30min，取出立即于自来水中冷却，然后检测残余活性及酶谱变化。

1.6 酸性条件对抑制剂稳定性的影响

吸取0.5mL上清液于离心管中，再加入0.5mL 0.05mol/L、pH1.5的KCl-HCl缓冲液，静置8h。然后检测残余活性及酶谱变化。

1.7 电泳分析[14-15]

称取1000.0mg豆粉用50mL蒸馏水于150mL三角瓶中振荡提取1h (37℃、180r/min)，12000r/min离心10min得TI提取液。提取液用蒸馏水稀释5倍，与等体积电泳样品缓冲液混合，取20μL进行明胶-PAGE。采用不连续垂直平板电泳系统，5%浓缩胶，12%分离胶，两种胶均含0.2%明胶，电极缓冲液为pH 8.3 Tris-甘氨酸；浓缩胶电压80V，分离胶150V，待溴酚蓝带跑出胶后继续电泳1h；取胶于培养皿中，用100mL胰蛋白酶溶液(25μg/mL，用脱酶液配制)振动酶解20min(摇床转速50r/min、37℃)，倒尽酶液，倒置培养皿，继续保温90min，然后用50mL脱酶液(pH7.5 0.05mol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，0.01mol/L CaCl2)漂洗凝胶2min，共漂洗3次；考马斯亮蓝R-250染色60min(摇床转速50r/min、37℃)，0.25mol/L NaCl溶液脱色。

2 结果与分析

2.1 不同绿豆种质胰蛋白酶抑制剂含量

表1 不同绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性(±s，n=3)Table 1 TI activity of mung bean cultivars (±s，n=3)

表1 不同绿豆品种胰蛋白酶抑制剂活性(±s，n=3)Table 1 TI activity of mung bean cultivars (±s，n=3)

绿豆 产地TI活性/(TIU/g)绿豆 产地TI活性/(TIU/g)郑绿8号 河南南阳35.2±0.3白绿522吉林白城42.2±2.6冀绿7号 河北石家庄53.5±2.2白绿8号 吉林白城35.4±3.3冀绿8号 河北石家庄42.0±2.4保942-34吉林白城32.7±1.7冀绿9号 河北石家庄31.2±2.1保绿942吉林白城40.7±0.7横山大明绿豆 陕西榆林38.4±3.3大鹦哥绿935吉林白城35.1±1.6神木绿豆 陕西榆林36.0±4.7冀绿19-2吉林白城43.2±2.2淮绿5号 山东青岛49.6±4.8冀绿2号 吉林白城37.5±2.9突泉明绿豆 内蒙古突泉44.0±2.2佳木斯绿 吉林白城35.4±3.4扎鲁特绿豆 内蒙古突泉30.2±0.7金峰绿豆直径3.6吉林白城29.0±0.3辽绿8号 辽宁沈阳43.2±5.7金峰绿豆直径3.8吉林白城33.6±1.7绿丰5号 黑龙江齐齐哈尔 34.8±2.2品种2号 吉林白城41.3±2.6绿丰2号 黑龙江齐齐哈尔 36.4±0.0中绿5号 吉林白城51.3±1.4 200143-10绿 吉林白城35.5±0.0中绿10号 吉林白城43.5±1.7

由表1 可知，2 6 个绿豆栽培品种T I 平均含量为38.9TIU/g，冀绿7号、中绿5号活性最高，分别达53.5、51.3TIU/g，金峰绿豆直径3.6最低，只有29.0TIU/g，高低相差0.8倍。

2.2 绿豆胰蛋白酶抑制剂多型性

图 1 绿豆、红小豆、黑大豆TI活性电泳酶谱Fig.1 TI zymogram of mung bean, adzuki bean and black soybean on Gel-PAGE

用非变性电泳TI活性染色方法对3个绿豆品种、3个红小豆品种以及3个黑大豆品种TI进行分析，结果如图1所示。绿豆有4条带，M2为主要组分，M4次之，其他微量；红小豆有7条带，其中A4为主要组分，A2、A6次之，其他微量，京农21缺失A3，A2含量也极低；黑大豆有8条带，S3为主要组分，S4、S7、S8为次要组分，其他微量。

2.3 绿豆胰蛋白酶抑制剂耐热性

图 2 绿豆TI热、酸处理活性显色电泳图Fig.2 TI activity staining PAGE of crude extract from mung bean treated by heat and acid

TI提取液于沸水中处理30min，冀绿7号、中绿5号、淮绿5号这3个品种的残余活性为66.4%～83.1%(表2)，明胶-PAGE活性显色有一定强度的活性带，见图2B，表明绿豆TI具有较高的耐热性。冀绿7号M4消失，出现5条新带(M5～M9)，中绿5号、淮绿5号未产生新带。

表2 绿豆胰蛋白酶抑制剂酸、热稳定性Table 2 Thermal and pH stability of mung bean TI

2.4 绿豆胰蛋白酶抑制剂耐酸性

由表2可知，TI提取液经pH1.5处理8h，冀绿7号、中绿5号的活性有所增加，达110.0%和107.7%，淮绿5号保存86.3%的活性，表明绿豆TI耐酸。活性电泳结果表明，冀绿7号M4消失，出现5条新带(M5～M9)(图2A)，中绿5号、淮绿5号未产生新带。

3 讨论与结论

3.1 TI种类及含量

供试的26个绿豆品种平均含38.9TIU/g，品种间差异较大，高低相差0.8倍。实验对3种黑大豆、17种红小豆的TI含量进行了测定，绿豆平均含量比红小豆、黑大豆低5倍以上。绿豆有4种TI，其中M2为主要组分。红小豆、黑大豆分别有7种、8种TI，主要组分分别为A4、S3。豆类TI种类及含量与植物品种、生理状态以及受病虫侵害程度有关[16]，TI的多型性具有重要的生物学意义，因为TI参与多种生理活动，因此需要不同种类和丰度的TI，如种子萌发、抗病虫等。据报道[17]新原料TI含量最高。实验发现提取液在冰箱放置一定时间后酶谱会改变。放置10d后M4显著增加，M1、M2、M3明显减少，因此，在研究TI多型性和含量时，必须用新材料及新提取液。

3.2 热稳定性

Klomklao等[11]报道绿豆TI经90处理60min可以保存90%以上的活性，本实验结果也表明绿豆TI具有较高的热稳定性。这些结果表明普通烹调方法不能完全使其失活。经100℃煮30min冀绿7号的M4消失，同时产生了M5～M9共5条活性带。

3.3 酸稳定性

Klomklao等[11]报道绿豆TI经pH2.0缓冲液处理30min保存87%的活性，本实验研究的3种绿豆经pH1.5处理8h，其中有2种的活性高于原液，另一种保存86.3%的活性，表明绿豆TI可以耐受胃酸。经pH1.5处理，冀绿7号的M4消失，同时产生了M5～M9共5条活性带。

3.4 TI存在状态

冀绿7 号经热或酸处理后M4消失，同时产生了M5～M9共5条新活性带，推测M4是以结合态形式存在。

利用明胶-PAGE分析TI种类和丰度受多因素的影响，如加样量、胰蛋白酶质量浓度、酶解时间、温度以及酶解方式。本研究采用低胰蛋白酶质量浓度(25μg/mL)、短时间(20min)浸泡酶解，然后倒掉酶液继续保温90min让残留在凝胶中的胰蛋白酶将明胶水解，这样可以避免TI被溶液中过量的蛋白酶所饱和而被降解，从而能够比较精细、准确分析TI种类及丰度。

绿豆TI属于Borman-Birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂，由72个氨基酸残基组成，分子中含有7对二硫键[18-19]，结构稳定，耐热耐酸，常规加热烹调和胃酸不能使其完全失活。豆类TI一方面可以抑制蛋白酶的活性影响蛋白的利用，但TI也具有一定的抑癌效果[4-6]，因此，如何科学食用绿豆值得深入研究。

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