单宁酸对纤维素酶和木聚糖酶活力的影响

田 野，欧仕益*

(暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632)

多酚类物质广泛存在于植物的根、皮、木、叶和果内，且含量丰富，在许多针叶树皮中的含量高达20%～40%，仅次于纤维素、木质素和半纤维素。此外，植物多酚具有许多活泼位点赋予它一系列独特的化学性质，其中植物多酚与蛋白质的结合是其最重要的特性之一[1]。

纤维素酶和木聚糖酶均属于高度专一的水解生物催化剂，在水解纤维质时起协同作用[2-4]。纤维素酶与木聚糖酶已广泛应用于食品工业中，如水解纤维多糖获得单糖和低聚糖、增加细胞壁的通透性从而提高细胞内含物(如蛋白质、淀粉、油脂、糖等)的提取率、简化食品加工工艺等[5-7]。但食品原料中丰富的多酚类物质对酶的影响限制了酶解效率。因此，研究多酚与酶的相互作用对食品工业生产具有重要意义。

单宁又称鞣质，是植物的主要多酚类物质，按其化学结构可分为水解单宁和缩合单宁两大基本类型[8-9]。本实验在多酚中选择单宁酸，将其按不同质量浓度分别添加到酶反应体系中，研究单宁酸对纤维素酶和木聚糖酶的影响，从而为工业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纤维素酶(1400U/mg)、木聚糖 广州市齐云生物技术有限公司；滤纸 杭州特种纸业有限公司；木聚糖酶(2500FXU(W)/g) 诺维信(中国)生物技术有限公司；单宁酸 天津市福晨化学试剂厂；3,5-二硝基水杨酸 美国Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SHA-B水浴恒温振荡器 江苏金坛市医疗仪器厂；HH-4恒温水浴锅 江苏金坛市宏华仪器厂；KDC-1044低速离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司；紫外-可见分光光度计、荧光光谱仪 美国Perkin Elmer仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 单宁酸对酶活力的影响

1.3.1.1 单宁酸对纤维素酶活力的影响

将滤纸剪成纸片(1cm×1cm)烘干后作为酶解底物。用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)配制质量浓度为10mg/mL的纤维素酶液和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的单宁酸溶液。取100mL三角瓶，各加入1g滤纸片、10mL单宁酸溶液和20mL酶液，在50℃的恒温振荡器振荡(100r/min)反应3h后，置于沸水浴中15min终止酶促反应。离心，取1mL上清液，用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定还原糖，各处理重复3次[10]。

1.3.1.2 单宁酸对木聚糖酶活力的影响

用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)分别配制质量浓度为2mg/mL的木聚糖酶液和5mg/mL的木聚糖液，以及质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL的单宁酸溶液。按1.3.1.1节方法设置酶促反应体系，反应结束后测定还原糖，各处理重复3次。

1.3.2 单宁酸影响酶活性的动力学研究

1.3.2.1 单宁酸影响纤维素酶活性的动力学研究

用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)配制质量浓度为2、4、6、8、10mg/mL的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液、4mg/mL的纤维素酶液及2.5mg/mL的单宁酸溶液。取5支10mL试管分别加入2mL纤维素酶液，在50℃水浴中孵育10min后，再依次加入2mL单宁酸溶液和4mL不同质量浓度的CMC-Na溶液，继续孵育5min。立即置于沸水浴中灭活。离心，取2mL上清液用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定还原糖，各处理重复3次。采用Lineweaver-Burk双倒数法制得酶动力学曲线，并计算Km和Vmax值。

1.3.2.2 单宁酸影响木聚糖酶活性的动力学研究

分别配制质量浓度为2、4、6、8、10mg/mL的木聚糖液，2.5mg/mL的单宁酸以及4mg/mL的木聚糖酶液(0.1mol/L、pH5.5醋酸-醋酸钠缓冲液配制)，按1.3.2.1节方法进行实验。采用Lineweaver-Burk双倒数法制得酶动力学曲线，并计算Km和Vmax值。

1.3.3 单宁酸对酶紫外差示光谱的影响

1.3.3.1 单宁酸对纤维素酶紫外差示光谱的影响

用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)配制质量浓度为4.7mg/mL纤维素酶液和质量浓度为0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的单宁酸溶液。取50mL三角瓶，各加入30mL纤维素酶液，5mL单宁酸溶液，混合，放置15min后，利用紫外-可见分光光度计在220～320nm波长范围内扫描，以缓冲溶液代替酶液作对照。各处理重复3次，记录其紫外差示光谱。

1.3.3.2 单宁酸对木聚糖酶紫外光谱的影响

用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)配制质量浓度为4.7mg/mL木聚糖酶液和0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的单宁酸溶液。按上述方法绘制其紫外差示光谱。

1.3.4 单宁酸对酶荧光光谱的影响

1.3.4.1 单宁酸对纤维素酶荧光光谱的影响

用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)配制质量浓度为4.7mg/mL纤维素酶液和0.9、1.8、3.5、7mg/mL的单宁酸溶液。取50mL三角瓶，各加入30mL纤维素酶液、5mL单宁酸溶液，混匀，放置15min后，分别在λEX=278nm和λEX=295nm波长处扫描300～400nm的荧光淬灭光谱；以缓冲溶液代替酶液作对照。各处理重复3次，记录其荧光光谱。

1.3.4.2 单宁酸对木聚糖酶荧光光谱的影响

用0.1mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)配制质量浓度为4.7mg/mL木聚糖酶液和0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的单宁酸溶液。按上述方法扫描300～400nm的荧光淬灭光谱，各处理重复3次，记录其荧光光谱。

1.3.5 单宁酸的测定

单宁酸吸光度=A1－A2

式中：A1为单宁酸与酶反应的吸光度；A2为缓冲液中相同质量浓度单宁酸的吸光度。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 单宁酸对酶活力的影响

图 1 不同质量浓度单宁酸对纤维素酶(a)和木聚糖酶(b)释放还原糖的影响(n=3)Fig.1 Effect of different concentrations of tannic acid on the release of reducing sugars by cellulase and xylanase (n=3)

由图1可知，单宁酸对纤维素酶具有抑制作用。这种抑制作用会随着单宁酸质量浓度的升高而增大。当单宁酸质量浓度为1.00mg/mL时，抑制率就达到35.33%。同样，单宁酸能抑制木聚糖酶的活力。这种抑制作用在单宁酸质量浓度为0.50mg/mL时达到最大，此时的抑制率为37.16%。当体系中单宁酸质量浓度超过0.50mg/mL时，还原糖质量浓度曲线会有所回升并趋于平缓。

2.2 单宁酸影响酶活性的动力学研究

表1 单宁酸对1mg/mL纤维素酶动力学参数的影响(±s，n=3)Table 1 Effect of different concentrations of tannic acid on kinetics parameters of cellulase(±s，n=3)

表1 单宁酸对1mg/mL纤维素酶动力学参数的影响(±s，n=3)Table 1 Effect of different concentrations of tannic acid on kinetics parameters of cellulase(±s，n=3)

项目CMC-Na质量浓度/(mg/mL)(mg/(mL·min))动力学方程Km/(mg/mL)反应速率/Vmax/(mg/(mL·min))1.000.19±0.01未加酚酸2.000.22±0.00 3.000.23±0.01 4.000.24±0.00 5.000.25±0.00 1/v=1.68×1/S+3.72(R2=0.9928)0.45±0.030.27±0.00 1.000.16±0.00单宁酸2.000.20±0.01 3.000.22±0.00 4.000.23±0.01 5.000.24±0.01 1/v = 2.51 × 1/S + 3.71(R2=0.9959)0.68±0.040.27±0.00

表2 单宁酸对1mg/mL木聚糖酶动力学参数的影响(±s，n=3)Table 2 Effect of different contractions of tannic acid on kinetics parameters of xylanase(±s，n=3)

表2 单宁酸对1mg/mL木聚糖酶动力学参数的影响(±s，n=3)Table 2 Effect of different contractions of tannic acid on kinetics parameters of xylanase(±s，n=3)

项目 木聚糖质量浓度/(mg/mL)(mg/(mL·min))动力学方程Km/(mg/mL)Vmax/(mg/(mL·min))反应速率/1.000.08±0.00未加酚酸2.000.15±0.00 3.000.21±0.01 4.000.26±0.01 5.000.32±0.01 1/v = 11.99 × 1/S + 0.77(R2=0.9996)15.62±0.30 1.30±0.02 1.000.09±0.00单宁酸2.000.14±0.01 3.000.18±0.01 4.000.22±0.00 5.000.27±0.01 1/v = 9.19 × 1/S + 2.27(R2=0.9869)4.05±0.54 0.44±0.03

如表1、2所示，单宁酸对纤维素酶具有竞争性抑制作用，表现为Km值显著增大，而最大反应速率基本不变。这表明单宁酸能够降低纤维素酶对底物的亲和力，从而抑制纤维素酶活力。与纤维素酶相比，单宁酸抑制木聚糖酶活力，表现为最大反应速率和Km值均显著减小，这说明单宁酸既能作用于游离的木聚糖酶，提高其亲和力，又能与酶-底物复合物结合，降低酶反应速度，从而表现对木聚糖酶的抑制作用。

2.3 单宁酸对酶紫外差示光谱的影响

由图2可知，纤维素酶和木聚糖酶的最大紫外吸收波长分别为280nm和278nm，这是由于色氨酸和酪氨酸等芳杂环对光的吸收。蛋白质分子中芳香族氨基酸残基所处的微环境改变，会导致最大吸收波长的变化[11-12]。

图 2 4 mg/mL纤维素酶(a)和木聚糖酶(b)的紫外吸收光谱Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of 4 mg/mL cellulase and xylanase

图 3 单宁酸对纤维素酶(a)和木聚糖酶(b)紫外差示光谱的影响Fig.3 Ultraviolet difference spectra of cellulase and xylanase before and after reaction with different concentrations of tannic acid

如图3所示，纤维素酶的吸收峰强度会随着单宁酸质量浓度增加而增大。当单宁酸质量浓度达到0.50mg/mL时，强度变化最大。同时，单宁酸会导致纤维素酶最大吸收波长蓝移，且质量浓度越小，蓝移程度越大，最大位移量为56nm。单宁酸质量浓度增加也会引起木聚糖酶的吸收峰强度增大。当单宁酸质量浓度高于0.13mg/mL时，强度变化较为明显。与纤维素酶不同的是，木聚糖酶最大吸收波长的变化较为复杂：较高质量浓度的单宁酸会导致木聚糖酶最大吸收波长蓝移，当质量浓度为0.50mg/mL时，最大蓝移量为27nm；而较低质量浓度的单宁酸会使木聚糖酶最大吸收波长发生红移，当质量浓度达到0.06mg/mL时，最大红移量为50nm。

结果表明，添加单宁酸后，酶分子中色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸残基所处的微环境受到干扰，进而酶分子结构也发生改变。

2.4 单宁酸对酶的荧光淬灭作用

2.4.1 单宁酸对酶荧光淬灭光谱的影响

在蛋白质分子中存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基，它们含有苯环结构或共轭双键，能吸收发射荧光，所以蛋白质具有内源荧光。但由于苯丙氨酸荧光极弱，对荧光有贡献的只有酪氨酸和色氨酸[13-14]。

图 4 单宁酸对纤维素酶荧光淬灭光谱的影响Fig.4 Fluorescence spectra of cellulase before and after being treated with different concentrations of tannic acid

由图4可知，分别以278nm和295nm波长光激发时，纤维素酶的发射波长分别为340nm和337nm。随着单宁酸质量浓度的增加，纤维素酶的荧光发射峰强度明显减少。此外，单宁酸对纤维素酶内源光发射波长的影响较小。在激发波长为278nm和295nm时，单宁酸所引起的最大红移量均为5nm。

由图5可知，木聚糖酶在278nm和295nm波长光激发下，最大发射峰分别为354nm和356nm。而且木聚糖酶淬灭程度随着单宁酸质量浓度的增加不断增强，当单宁酸质量浓度达到0.50mg/mL时，荧光几乎完全淬灭。同样，木聚糖酶在单宁酸作用下最大发射波长基本不变，红移量依次为3nm和5nm。

以上结果表明：添加的单宁酸与酶蛋白分子中的色氨酸和酪氨酸残基发生相互作用，干扰了酶的构象，使上述2种氨基酸残基所处的疏水环境发生了明显变化。此外，不同波长激发时，荧光发射峰的强度也不同，278nm激发明显强于295nm激发，这是因为前者会使色氨酸和酪氨酸同时受到激发，而后者只能激发色氨酸[15-16]。

图 5 单宁酸对木聚糖酶的荧光淬灭光谱的影响Fig.5 Fluorescence spectrum of xylanase before and after being treated with different concentrations of tannic acid

2.4.2 单宁酸对酶的荧光淬灭机制

荧光淬灭过程实际上就是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿命的过程，可分为动态淬灭和静态淬灭2种。动态淬灭是指淬灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生相互作用(如：能量转移或电子转移)，产生瞬时的激态复合物，这些复合物可能不发射荧光，或者荧光的发射特性与原来的荧光物质不同，从而引起荧光淬灭现象。而静态淬灭是淬灭剂和荧光物质分子在基态时发生配合反应，产生不发光的配合物。如果单宁酸对纤维素酶和木聚糖酶的荧光淬灭为动态淬灭，需满足Stern-Volmer方程[15-16]，即：

式中：F0为无淬灭剂存在时荧光物质的荧光强度；F为淬灭剂存在时荧光物质的荧光强度；Kq为分子淬灭常数；τ0为无淬灭剂存在时物质的荧光寿命(生物大分子的荧光平均寿命约为10-8s[17])；Ksv为动态淬灭常数；[Q]为淬灭剂浓度。

选择278nm波长光激发时的荧光光谱，以荧光光谱的相关数据做F0/F-[Q]图，从中求出单宁酸分别与2种酶相互作用后的Kq，再与各类淬灭剂对生物大分子的最大扩散常数1.0×1010L/(mol·s)比较[17]。结果表明，2种酶的Kq均大于最大扩散常数，单宁酸对酶的荧光淬灭作用属于静态淬灭，即反应中形成了以非共价键结合的某种不发光的配合物。

表3 单宁酸淬灭酶荧光的Stern-Volmer方程Table 3 Parameters obtained from Sterm-Volmer equation after cellulase and xylanase reacted with tannic acids

由于单宁酸能与纤维素酶和木聚糖酶形成非荧光配合物，在此基础上，进一步可得到两者之间结合常数和结合位点数。按照静态淬灭方程[17-18]。

式中：F0为无淬灭剂存在时荧光物质的荧光强度；F为淬灭剂存在时荧光物质的荧光强度；KA为静态结合常数；[Q]为淬灭剂浓度；n为结合位点的数目。

表4 单宁酸淬灭酶荧光的静态淬灭方程Table 4 Static quenching parameters of cellulase and xylanase after reaction with tannic acid

由表4所示，单宁酸与酶分子结合程度不同，木聚糖酶明显高于纤维素酶。此外，上述2种酶与单宁酸之间均只有一个结合位点。

一般来讲，多酚类物质对酶促反应的抑制作用是多方面因素共同作用的结果：1)酶的化学本质是蛋白质，酶与多酚结合生成不溶性的结合物，该结合物较酶的构型有所改变，从而造成酶活力的降低或丧失；2)对于以生物大分子为底物的酶促反应，多酚物质也可同底物结合，剥夺酶的催化底物或生成能降低酶活性的化合物[19]。

根据Haslam等[9]的研究发现，多酚会在蛋白质分子之间形成空间网状结构，当反应体系中蛋白质质量浓度不同时，与多酚的结合方式也不同[20]。1)当多酚质量浓度远大于蛋白质质量浓度时，多酚分子会在蛋白质分子表面形成单分子疏水层，其疏水性使多酚-蛋白质复合物沉淀析出；2)随着蛋白质质量浓度升高，当其结合点数与多酚分子数目平衡时，形成多酚-蛋白质的网状结构。理论上讲，此时的沉淀量达到最大；3)当蛋白质质量浓度远大于多酚质量浓度时，多酚-蛋白质的网状结构被破坏，沉淀量会有所降低。

单宁酸对酶的抑制主要是由于单宁酸与酶的结合，即单宁酸对酶的抑制具有选择性，这是因为多酚-蛋白质的结合反应本身是一种分子识别反应，2种反应物之间相互选择[19]。因此，单宁酸对纤维素酶和木聚糖酶存在不同的有效抑制质量浓度。这种选择性同样表现在对于不同酶产生不同的抑制作用，单宁酸与纤维素酶结合，改变其构象，进而降低纤维素酶对底物的亲和力；相反，单宁酸结合游离的木聚糖酶，促进其与底物的结合，同时又与酶-底物复合物结合，阻碍还原糖的释放，从而达到抑制效果。

3 结 论

单宁酸对纤维素酶和木聚糖酶均具有抑制作用。其抑制效果分别在单宁酸质量浓度达到1.00、0.50mg/mL时达到最大，此时抑制率依次为35.33%、37.16%。此外，当木聚糖酶反应体系中的单宁酸超过最大抑制质量浓度时，其抑制效果会有所降低；若继续添加，抑制效果基本保持不变。

动力学研究表明，单宁酸能够通过不同方式降低两种酶的活力。单宁酸能够降低纤维素酶与底物的亲和力，从而表现其对纤维素酶的竞争性抑制作用；而对木聚糖酶的抑制作用，表现为与酶-底物复合物结合，降低酶反应速度，引起还原糖释放量的降低。

单宁酸能够干扰酶蛋白分子的构象，使酪氨酸和色氨酸残基所处的微环境发生明显的变化，从而引起纤维素酶和木聚糖酶紫外差示光谱及荧光光谱的变化。酶紫外吸收峰强度会随着单宁酸质量浓度增加而增大，但位移变化较为复杂：低质量浓度单宁酸分别会引起纤维素酶及木聚糖酶最大吸收波长的蓝移(最大蓝移量56nm)和红移(最大红移量50nm)；而高质量浓度单宁酸会导致木聚糖酶最大吸收波长蓝移(最大蓝移量27nm)。

荧光光谱结果表明，单宁酸质量浓度越高，对酶的荧光淬灭程度越强，且最大发射波长出现红移现象，红移范围是3～5nm。这说明酶蛋白分子中的酪氨酸和色氨酸残基与单宁酸结合。通过分析其对2种酶荧光淬灭作用的相关数据，证明单宁酸均能与酶分子的特定位点结合，形成稳定的配合物，从而影响其生物学功能；其结合部位应为芳香族氨基酸残基，且只有一个结合位点。

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