海洋链霉菌GB-2产西索米星发酵条件优化

李金良，张 莉，李春燕，彭意开，王 颖，吕凤霞，陆兆新*

(南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095)

西索米星(Sisomicin)是一种重要的氨基糖苷类抗生素，它的半合成化合物奈替米星(Natimicin)有高效低毒的特性，是氨基糖苷类抗生素中较理想的一个品种，应用广泛[1-4]。目前国内生产的Sisomicin原料药约占世界产量的80%以上[5]，采用的生产菌株主要是朱坚屏等[6]筛选得到的橄榄星孢小单孢菌无锡亚种和福州大学陈剑锋等[7]采用的伊尼奥小单孢菌M.inyoensis F003。该两种生产菌株皆为小单孢菌，目前国内外尚未发现小单孢菌以外的Sisomicin生产菌株，经多年菌种改造和发酵工艺优化[8-9]后仍不能完全满足市场的需要。近年来在Sisomicin高产菌株筛选、菌种改造等方面的报道有所减少[10-11]，相反生产工艺的研究却日趋成熟[12-13]，产量进一步提升的空间有限。因此，筛选新型、高产菌株有望突破限制Sisomicin生产能力进一步提升的瓶颈。

本实验室从连云港海域潮间带采集的样品中筛选到1株具有高抑菌活性的链霉菌株——海洋链霉菌GB-2[14]，经分离纯化鉴定，其抑细菌活性物质为Sisomicin[15-16]。这是首次发现小单孢菌以外的Sisomicin生产菌株，发酵液在121℃、紫外照射、pH1和pH12处理条件下抑菌活性基本不变[15]，具有重要的市场开发价值。

事实上，菌种选育和过程控制是提高次级代谢产物产量最常用的两种手段[17-18]，在优势菌株的基础上通过对pH值、温度、溶氧(DO)、培养基组分等条件的调控可以达到快速提高产量的目的。PB设计结合响应曲面法(RSM)[19]已被证明是一种快速、有效的统计筛选和复杂优化的技术手段，越来越广泛地应用于抗生素[20]、工业用酶[21]和化学提取[22]等方面。本实验通过响应面设计[23]优化海洋链霉菌GB-2产Sisomicin的发酵条件，确定主要响应因素的最佳水平和交互作用，以期达到提高产量、降低成本的目的，为工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

海洋链霉菌GB-2 南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏[14]，原发酵条件下效价387.03U/mL。指示菌株短小芽孢杆菌(CMCC(B)63202)，购自中国科学院微生物菌种保藏中心。

供试菌株活化培养基：高氏一号合成培养基[14]；种子及原始发酵培养基：黄豆粉培养基[14]；指示菌株培养基：营养琼脂培养基[14]；PB设计与RSM发酵培养基：按实验设计配制。

1.2 培养方法

1.2.1 种子液制备

用接种环挑取2环活化好的斜面菌种到含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养48h，作为种子液。

1.2.2 发酵培养

将种子液以实验设计接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，置于设定发酵条件下培养120h，发酵结束后放瓶备用。

1.2.3 指示菌的培养 将短小芽孢杆菌在营养琼脂培养基斜面上活化，30℃培养14～18h，临用前用生理盐水清洗备用。

1.3 Sisomicin产量的测定

发酵液预处理：将培养好的发酵液置于10000r/min离心15min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，4℃保存备用。

微生物效价检定：采用杯碟法[24]，发酵优化阶段效价采用一剂量法测定，原始效价与优化后效价采用三剂量法测定。

1.4 实验设计

1.4.1 PB试验筛选关键因子

从培养基和培养条件两个方面考虑关键因子的选择，玉米粉、黄豆粉、葡萄糖、酵母膏是常用的放线菌发酵原料，PB设计中量的确定由多次单因素试验测得，发酵时间根据生产曲线确定，初始pH值参照发酵前后发酵液pH值变化确定，温度、转速、接种量为分析比较海洋链霉菌GB-2和小单胞菌M.inyoensis F003基本特性后确定。因此，在本实验中所选择的因素主要有：玉米粉、黄豆粉、葡萄糖、酵母膏、发酵时间、摇床转速、接种量、起始pH值和发酵温度，分别用X1～X9表示。发酵液预处理后经适当稀释测定生物效价。以效价(titer)为响应值，每一自变量的低、高试验水平分别以－1、1进行编码。试验设计和数据分析皆采用JMP软件(version7.0，SAS Institute Inc.)，每组设2次重复，结果取平均值。因素编码及自变量水平见表1。

表1 PB筛选设计试验因子水平及编码Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman screening design

1.4.2 响应面试验设计

根据PB设计的试验结果与中心组合试验(CCD)的设计原理[25-26]，分别用X1、X2、X3、X4表示黄豆粉、葡萄糖、温度、摇床转速。对于其他影响不显著的参数，皆选定在低水平。发酵液预处理后适当稀释进行生物效价测定。以效价为响应值，每一自变量的低、中、高试验水平分别以－1、0、1进行编码。试验设计和数据分析皆采用Design-Expert软件，每组设2次重复，结果取平均值。因素编码及自变量水平见表2。

表2 中心旋转设计试验因素水平及编码Table 2 Factors and levels for CCD

该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程为：

式中：Y为预测响应值；A0为常数项；Ai为线性系数；Aii为二次项系数；Aij为交互项系数；xi、xj为自变量编码值。按照中心组合试验设计的统计学要求，设2个中心点，需要进行26组试验。

2 结果与分析

2.1 影响海洋链霉菌GB-2产Sisomicin关键因子的确定

表3 Plackett-Burman 设计与结果Table 3 Plackett-Burman design and results

PB的试验方案及结果见表3，统计学分析表明该筛选模型显著(P＜0.05)，影响海洋链霉菌GB-2产Sisomicin的主要因素是：黄豆粉(P=0.0015)、葡萄糖(P=0.00016)、转速(P=0.0038)和温度(P=0.000026)，此4个因素都在95%水平上差异显著。玉米粉、酵母膏、发酵时间、接种量和pH值在95%水平上差异不显著，说明其接近最优水平或者远离试验考虑范围。因此，选择黄豆粉、葡萄糖、温度、转速作为影响海洋链霉菌GB-2产Sisomicin的关键因素，其余因素皆选定为低水平进行后续响应面试验。

2.2 响应面试验设计及结果分析

2.2.1 海洋链霉菌GB-2产Sisomicin多元二次模型方程的建立及检验

根据PB试验结果和中心组合试验的设计原理，做四因素三水平的响应面分析，试验设计及结果见表4，1～24是析因试验，25、26是中心试验，用来估计试验误差。

对表4的数据进行回归拟合，可以得到效价对编码自变量黄豆粉、葡萄糖、转速和温度的二次多项式方程：

从表5对模型的方差分析结果看，本实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P＜0.0001)，失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.1568＞0.05)，仅有约7.5%的实验变异不能由该模型预测(R2Adj=0.9247)。从回归方程各项的显著性检验可以看出，转速对Sisomicin效价的曲面效应显著，黄豆粉、葡萄糖、温度不显著；葡萄糖和黄豆粉的交互作用影响显著，其余均不显著；葡萄糖、温度、转速的线性影响效应显著。

表4 RSM设计方案及响应值的测定值Table 4 Expeirmental design and response results for RSM

表5 响应面二次多项模型及其各项的方差分析表Table 5 ANOVA for the response surface quadratic model

2.2.2 海洋链霉菌GB-2产Sisomicin响应面交互作用与优化

为确认黄豆粉质量浓度、葡萄糖质量浓度、温度、摇床转速4个因素对海洋链霉菌GB-2产Sisomicin交互作用的影响，根据上述回归方程绘出响应面分析图以及等高线图。

图 1 黄豆粉和葡萄糖质量浓度交互作用影响Sisomicin效价的响应面图和等高线图Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of oybean flour and glucose concentration on sisomicin production

图1显示了在温度和转速位于中心水平时，黄豆粉和葡萄糖对海洋链霉菌GB-2产Sisomicin效价的响应面图及等高线图。可以看出此两因素交互作用显著[27-28]。葡萄糖与黄豆粉之间的比例变化会较大影响Sisomicin的产量，且两者存在一定的协同作用，这说明合适的碳氮比(C/N)海洋链霉菌GB-2菌体生长和Sisomicin的合成需要控制合适的C/N。葡萄糖等速效碳源在低质量浓度时能够促进菌株的生长，缩短调整期，但是在质量浓度较高时会引起菌体过量生长，其他营养物质耗尽而缩短发酵时间，过量部分葡萄糖又会导致pH值下降，对抗生素发酵产生抑制或阻碍作用[5,29]，这在本实验中也得到了验证。黄豆粉是大部分氨基糖苷类抗生素发酵生产时的主氮源，在低质量浓度时提高黄豆粉的量可以延长发酵时间从而实现高产。但是在本实验室条件下摇瓶发酵时，黄豆粉质量浓度过高则会导致培养基会过于黏稠而影响氧气传递，反而引起Sisomicin产量下降。

本实验在分析4个影响因子时，发现仅有黄豆粉和葡萄糖交互作用显著，其余因子之间交互作用皆不显著，这与Adinaryanak[25]、Raza[29]等的报道不符，此两位学者在相关优化研究中皆发现了4组交互作用显著的因子。推测其原因可能为它们都是分析因子对发酵的影响，影响机理或作用机制相似，而非像本实验中将培养基和培养条件一并进行分析。由此，本实验可进一步推测海洋链霉菌GB-2在发酵生产Sisomicin时，培养基与培养条件之间不存在明显的交互作用，即两者变化互不影响。因此，在以后诱变株以及基因工程菌株优化时可以将培养基与培养条件分别进行优化以缩短研究时间，降低成本。

温度对抗生素发酵影响显著，过高或者过低都会影响菌株生长以及多种酶的活性，严重时甚至改变代谢途径。朱坚屏等[30]在对橄榄星孢小单孢菌M-41发酵生产西索米星进行优化研究中发现在在33～35℃时可以达到一个较高发酵效价平台，并建议在工业生产中温度应该控制在(34±0.5)℃。这与本研究发现的28℃存在较大差别。海洋链霉菌GB-2自海洋中筛选得到[14]，适宜在常温(25℃)条件下发酵，温度过高不利于发酵进行，这是海洋链霉菌GB-2与小单孢菌的一个典型差别。

海洋链霉菌GB-2发酵生产Sisomicin是好氧发酵过程，成熟菌丝细成长链状，摇床转速过高或过低都会对Sisomicin发酵带来不利影响，摇床转速过低会导致通气量不足，难以满足正常生长需要，过高则会导致菌丝断裂，菌的形态发生变化，改变了培养液的流变学特性，导致抗生素生物合成能力的下降。这与朱坚屏等[30]的报道相一致。

根据多元二次模型方程和因素显著水平，计算出效价(Y)的最大值为726.11U/mL，此时Y值所对应的xi分别为x1=11.95，x2=2.96，x3=27.80，x4=183.43，即海洋链霉菌GB-2发酵产Sisomicin的最适摇瓶发酵条件为玉米粉20g/L、黄豆粉11.95g/L、葡萄糖2.96g/L、酵母膏2.5g/L、碳酸钙1g/L、接种量5%、pH7.0、温度28℃、摇床转速183r/min(根据实际生产情况将转速由理论值183.43r/min调整为实际值183r/min)、发酵时间120h，此时海洋链霉菌GB-2液体发酵上清液中Sisomicin的产量为726.11U/mL。

2.2.3 回归模型的验证实验

为了检验模型预测的准确性在最佳发酵条件下进行3次平行实验，所得发酵上清液中Sisomicin的产量平均为743.66U/mL，实验值与理论值的相对标准偏差(RSD)仅为2.0792%，可见采用PB和RSM试验可以很好地对海洋链霉菌GB-2发酵生产Sisomicin进行优化。

福州大学陈剑锋等[7]采用的伊尼奥小单孢菌M.inyoensis F003发酵液中以纯组分计Sisomicin质量浓度约为0.9～1.1g/L(相当于493.2～602.8U/mL)，优化后的海洋链霉菌GB-2发酵产Sisomicin效价已高于目前市场上正在使用的小单孢菌生产菌株，展现出了良好的工业应用价值。与工业上应用广泛的伊尼奥小单孢菌发酵相比，还需继续对海洋链霉菌GB-2进行育种改良[31-32]、工艺调控、无机盐及微量元素调节和分子生物学[33-34]等方面的研究。

3 结 论

海洋链霉菌GB-2是除小单孢菌以外新型Sisomicin生产菌株。本实验在PB筛选设计的基础上，通过RSM法对关键因子以及它们之间的交互作用进行优化，得到了影响海洋链霉菌GB-2产Sisomicin的二次多项数学模型。通过分析得出，经过优化后最适摇瓶发酵条件为玉米粉20g/L、黄豆粉11.95g/L、葡萄糖2.96g/L、酵母膏2.5g/L、碳酸钙1g/L、接种量5%、pH7.0、温度28℃、摇床转速183r/min、发酵时间120h，此时海洋链霉菌GB-2液体发酵上清液中Sisomicin的产量为726.11U/mL，与原发酵条件下效价387.03U/mL相比，产量提高了87.61%。

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