低聚果糖、乳酸杆菌对便秘模型大鼠的通便功能影响

刘晓梅，彭芝榕，倪学勤,3,*，杨 杰，邹昭勇，邱春红，曾 东,3，杨立格

(1.四川农业大学动物医学院动物微生态研究中心，四川 雅安 625014；2.四川农业大学动物医学院生物工程系，四川 雅安 625014；3.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014)

便秘是临床常见的复杂症状，随着人们饮食结构的改变及精神心理和社会因素的影响，便秘发病率有增高趋势，困扰着多数职场人士和众多的老年人，严重影响他们的生活质量。便秘人群易出现肠道菌群紊乱，长期便秘还与急性心脑血管疾病、痴呆、结直肠癌等有密切的关系[1-4]。研究表示，近十几年来，因各类便秘治疗药物在临床研究和应用中显现诸多问题，比如疗效不确切、特异性不强、不良反应多和治疗范围局限等缺陷，没得到更多的研究与开发[5]。刘会艳等[6]认为微生态制剂可直接补充正常生理性细菌，调整肠道菌群，促进机体对营养物质的分解与吸收，较适用于老年人便秘的治疗。乳酸杆菌作为有益菌，可通过其抑菌活性、免疫增强作用及促进营养物质消化吸收等方面的作用而维持宿主肠道微生态平衡、增强宿主免疫功能并提高动物生产性能，加强肠道的蠕动和消化液的分泌[7-8]，改善老年人习惯性便秘[9-10]。低聚果糖(fructooligosaccharide，FOS)又称果寡糖，是低聚糖类微生态调节剂中最常用的制品之一，可选择性增值双歧杆菌，抑制有害菌的增殖，促进肠道蠕动，尤其适用于老年人[11-13]。郑丽华等[14]指出，长期服用果导片、番泻叶、芦荟胶囊等治疗便秘的药物，会造成电解质紊乱、低血钾、维生素缺乏、肠道炎症，严重可诱发结肠黑变等癌前病变和精神源性假性梗阻，因此针对便秘的药物研究，主要集中于胃肠动力剂、渗透性泻药以及纯天然药物。低聚果糖和乳酸杆菌均为天然药物，都具有通便作用，但是最佳使用剂量和相互的比较未见报道。因此本项目拟参照文献[15]，使用盐酸洛哌丁胺建立Wistar大鼠便秘模型，探讨不同剂量低聚果糖和乳酸杆菌对便秘大鼠通便功能的影响，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳酸杆菌由四川农业大学动物医学院动物微生态研究中心提供。

番泻叶、盐酸咯派丁胺 雅安市怡人堂大药房；低聚果糖(纯度≥90%) 广东省江门星子高科生物股份有限公司；其余试剂均为分析纯。

PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱 上海市跃进医疗器械一厂；SW-CJ-2FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱、台式高速冷冻离心机 美国Thermo公司；CMD-20X智能型电热恒温鼓风干燥箱 上海琅实验设备有限公司；BCD-213K/T柜式冰箱 Haier公司。

1.2 受试动物

健康S P F 级雄性Wistar 大鼠3 6 只，体质量为(130±3.67)g，购自成都达硕生物有限公司，动物合格证号：scxk(川)2008-24。在四川农业大学兽医院动物实验房(室温(23±1)℃，相对湿度45%～50%，12h光照：12h黑暗)以标准饲料单笼适应饲养7d后开始实验。

1.3 受试样品

低聚果糖溶液：高剂量(0.5g/mL)、中剂量(0.25g/mL)、低剂量(0.125g/mL)3个剂量组。

乳酸杆菌菌悬液：将植物乳酸杆菌活化、扩大培养后进行计数，分别配制高(1.0×1010CFU/mL)、中(1.0×109CFU/mL)、低(1.0×108CFU/mL)3个剂量组。

番泻叶浸剂：称取药用番泻叶5.0g置于100.0mL沸水中浸泡25min，冷却后以纱布过滤药液，弃药渣不用，所得的番泻叶溶液定量至1000mL，得含生药5.0×10-3g/mL的番泻叶浸液，115℃灭菌15min后置4℃冰箱备用。

1.4 方法

1.4.1 大鼠便秘模型造模[15]

取体质量接近的Wistar大鼠36只，随机选4只作为正常对照组(第1组)，灌胃生理盐水，其余大鼠连续3d按3.0mg/kg体质量灌喂咯派丁胺(咯派丁胺溶于1.0mL质量分数为0.9%的生理盐水)造便秘模型。

1.4.2 便秘大鼠分组与处理

取造模成功的32只大鼠，随机分成8组，每组4只，分别为：第2组(模型对照组)、第3组(番泻叶浸剂治疗对照组)、第4组(乳酸杆菌高剂量组)、第5组(乳酸杆菌中剂量组)、第6组(乳酸杆菌低剂量组)、第7组(低聚果糖高剂量组)、第8组(低聚果糖中剂量组)、第9组(低聚果糖低剂量组)。除第1组和第2组外，其余各组大鼠按2.0mL/kg体质量的剂量连续7d灌胃相应受试样品，第1、2组同法同量灌胃生理盐水。

1.4.3 测定指标

在便秘模型造模3d与受试样品灌喂7d期间，记录大鼠采食量(mL)、饮水量(mL)、体质量增量(g)、最后24h的粪便粒数、粪便鲜质量和干质量，按式(1)计算粪便含水率。

式中：mf为粪便鲜质量/g；md为粪便干质量/g。

1.4.4 小肠运动实验

第7天灌胃受试样品后，所有大鼠禁食不禁水24h，每只大鼠灌喂1.0mL炭末液(3.0g炭末溶于50.0mL 0.5%羧甲基纤维素钠溶液)，30min后断颈处死，剖腹，将消化道幽门至回盲瓣部分完全取出，测量小肠全长及炭末推进长度，按式(2)计算小肠炭末推进率。

1.4.5 肠道菌群检测[16]

第7天灌胃受试样品后，收集大鼠新鲜粪便，取0.2～0.5g粪便经PBS 10倍递增稀释成10－1～10－6倍系列稀释液，取适当稀释度样品10μL接种在各类培养基上，每个稀释度做3个重复。按相应要求和条件进行培养，以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，求平均值，计算每克湿便中的菌数。双歧杆菌和乳酸杆菌分别用TPY琼脂和MRS琼脂，37℃厌氧培养48h。肠杆菌用EMB琼脂，37℃需氧培养48h。肠球菌用EC琼脂，37℃需氧培养48h。

1.5 数据处理

采用SPSS 20.0软件包对所得数据进行统计分析，各组以变异数(ANOVA)进行比较，采用Duncanny’s multiple range test方法分析。如遇显著差异时再进一步以邓肯氏新多变域验定分析处理均数间之差异，数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 大鼠便秘模型造模

在整个实验期间，大鼠均正常生长。由表1可知，模型对照组采食量、饮水量、体质量增量、粪便粒数以及粪便含水率均明显低于正常对照组(P＜0.05)，实验期间未出现大鼠腹泻现象，表明Wistar大鼠便秘模型造模成功。

表1 正常对照组和模型对照组的采食量、饮水量、体质量增量、粪便粒数及粪便含水率比较(±s, n=4)Table 1 Comparison of feed intake, water intake, body mass gain, number of feces grains and feces moisture content beween control group and constipation group (±s, n=4)

表1 正常对照组和模型对照组的采食量、饮水量、体质量增量、粪便粒数及粪便含水率比较(±s, n=4)Table 1 Comparison of feed intake, water intake, body mass gain, number of feces grains and feces moisture content beween control group and constipation group (±s, n=4)

注：同行不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。

指标 正常对照组 模型对照组采食量/g70.13±5.9856.98±6.29a饮水量/mL145.50±12.7995.25±27.11a体质量增量/g12.25±5.561.75±4.72a粪便粒数39.50±8.1025.25±4.99a粪便含水率/%52.65±5.3743.63±3.71a

2.2 受试样品对便秘大鼠采食量、饮水量、体质量增量、排便功能和小肠运动的影响

由表2可知，各受试样品组与第2组相比，大鼠的采食量均极显著提高(P＜0.01)，其中第4组的采食量最高并显著高于第5、6组(P＜0.05)；除第7、8组外，其他受试样品组便秘大鼠的饮水量均极显著提高(P＜0.01)；除第8组外，其他组大鼠的小肠炭末推进率均极显著提高(P＜0.01)；除第5、9组外，其他组大鼠的粪便粒数均显著增加(P＜0.05)，其中，第6、7组大鼠的粪便粒数均极显著增加(P＜0.01)；除第4组外，其他组大鼠的粪便含水率均显著提高(P＜0.05)，其中，第6、7、8组大鼠的粪便含水率均极显著提高(P＜0.01)。表明给予受试样品后，均可提高便秘动物采食量，对其无不良健康影响并具有通便功能，且以第6、7组效果最好。各组与第3组相比，除第6组外，其他组的采食量均极显著提高(P＜0.01)；除第5、8组外，其他各组饮水量均与第3组差异不显著；第6、9组大鼠的小肠炭末推进率显著低于第3组(P＜0.05)，第4、5、7组大鼠的小肠炭末推进率极显著低于第3组(P＜0.01)。表明低聚果糖、乳酸杆菌较番泻叶可更好的维持便秘动物正常饮食且具有如番泻叶般的通便功能，但小肠推动作用结果提示番泻叶的通便效果较佳。与第1组相比，受试样品除第5、8组外，大鼠的体质量显著增加(P＜0.05)，其中以第6、7、9组增加量较高，表明受试样品对大鼠的生长发育无不良影响。

表2 受试样品对便秘大鼠采食量、饮水量、体质量增量、排便功能和小肠运动的影响(±s，n=4)Table 2 Effect of fructooligosaccharides and Lactobacillus on feed intake, water intake, body mass increase, bowel function and small intestine movement of constipation rats (±s，n=4)

表2 受试样品对便秘大鼠采食量、饮水量、体质量增量、排便功能和小肠运动的影响(±s，n=4)Table 2 Effect of fructooligosaccharides and Lactobacillus on feed intake, water intake, body mass increase, bowel function and small intestine movement of constipation rats (±s，n=4)

注：同列不同大写字母代表差异极显著(P＜0.01)；不同小写字母代表差异显著(P＜0.05)。下同。

组别 采食量/g饮水量/mL体质量增量/g 小肠炭末推进率/%粪便粒数 粪便含水率/%第1组 119.76±3.20Ccd 225.10±30.14BCcd 13.00±4.36a75.65±1.35Cc44.75±6.95Bc66.30±8.39Ce第2组 102.30±5.55Aa 184.33±28.60ABab 12.00±5.00a50.92±5.59Aa31.25±1.71Aa58.52±4.36Aa第3组 111.16±2.12Bb 213.70±19.36ABCbc 12.67±2.52a76.12±4.89Cc39.00±6.78ABbc 63.10±1.23BCcde第4组 125.01±3.97Cd 230.85±11.10Ccd 21.00±3.60bc62.30±2.48Ba38.25±4.92ABbc 59.00±3.64ABab第5组 118.61±3.29Cc 249.30±14.81Cd12.33±2.31a65.50±3.65Bb34.50±2.52ABabc 61.35±3.76ABbc第6组 117.93±5.72BCc 227.18±6.14Ccd27.67±4.73d68.12±4.03BCb42.00±2.94Bbc 67.95±2.60BCcde第7组 120.88±2.23Ccd 223.00±25.39BCcd 22.33±2.52bcd63.15±6.94Bb41.00±3.56Bbc 71.38±2.58Cde第8组 120.25±2.36Ccd 178.00±20.85Aa 17.67±2.08ab46.57±3.21Aa37.25±7.80ABbc 65.86±7.39BCbcd第9组 122.12±1.67Ccd 240.00±11.55Ccd 26.67±2.08bcd66.98±4.73BCb34.25±6.29ABab 61.12±4.84ABbc

2.3 受试样品对便秘大鼠肠道菌群的影响

表3 受试样品对便秘大鼠肠道菌群的影响(±s，n=4)Table 3 Effect of ructooligosaccharides and Lactobacillus on the intestinal flora of constipation rats (±s，n=4) lg(CFU/g)

表3 受试样品对便秘大鼠肠道菌群的影响(±s，n=4)Table 3 Effect of ructooligosaccharides and Lactobacillus on the intestinal flora of constipation rats (±s，n=4) lg(CFU/g)

组别 肠球菌 大肠杆菌 乳酸杆菌 双歧杆菌第1组5.63±0.16a4.14±0.31abc7.63±0.387.33±0.46ab第2组7.11±0.20d5.04±0.43d6.74±0.557.20±0.27ab第3组6.17±0.80abc 3.98±0.41ab6.76±0.507.04±0.10a第4组6.94±0.11cd 4.48±0.68bcd8.06±0.797.98±0.71b第5组5.82±0.32a3.57±0.60a7.51±0.897.83±0.43ab第6组5.99±0.63ab3.58±0.32a7.59±0.647.75±0.65ab第7组6.17±0.49abc 4.76±0.17cd7.24±0.777.86±0.35ab第8组6.87±0.37bcd 3.91±0.09ab7.18±0.916.96±0.59a第9组6.78±0.31cd4.91±0.27d7.40±0.377.86±0.35ab

由表3可知，各实验组与第2组相比，有害菌肠球菌、大肠杆菌均表现下降的趋势，受试样品均在不同程度上抑制肠球菌、大肠杆菌的生长繁殖，其中第6、7组大鼠的肠球菌、大肠杆菌菌数显著低于第2组(P＜0.05)，抑菌效果显著；各组大鼠的乳酸杆菌、双歧杆菌均差异不显著，无统计学意义。说明受试样品有抑制大鼠肠道有害菌生长繁殖的作用，对有益微生物的生长繁殖无不良影响。

3 讨论与结论

番泻叶作为通便药物已应用多年[17]，而低聚果糖和乳酸杆菌制剂对便秘患者的润肠通便作用哪个效果更好又健康，以及其最佳使用剂量仍有待探索。研究表明，番泻叶浸剂具有增强胃肠道推进作用和抑制肠道吸收液体，促进肠液分泌，机械性刺激肠壁而使蠕动增强的作用[18]；低聚果糖在体内外均对双歧杆菌有显著地增殖作用，并在肠道内通过双歧杆菌发酵，产生大量的短链脂肪酸，刺激肠道蠕动、增加粪便湿润度并保持一定的渗透压，从而防止便秘的产生，对产荚膜梭菌、大肠杆菌、艰难梭菌的生长有一定的抑制作用[19]；乳酸杆菌制剂则通过调节免疫、拮抗肠道致病菌等保持肠道微生态平衡，从而有益于维持宿主肠道正常功能[10-11]。

本实验采用盐酸洛派叮胺为便秘诱导剂，通过抑制肠道水分泌[20]和结肠蠕动[21]建立便秘模型，以番泻叶浸剂为阳性对照组，探讨不同剂量乳酸杆菌和低聚果糖的通便效果。结果表明不同剂量受试样品均起到了维持便秘动物正常饮食和抑制肠球菌、大肠杆菌等有害菌生长繁殖的作用，对大鼠生长和肠道有益菌繁殖无不良影响；低聚果糖、乳酸杆菌对便秘大鼠的通便作用和抑制肠球菌、大肠杆菌生长繁殖的作用与番泻叶相当，其中低聚果糖高剂量和乳酸杆菌低剂量组效果显著，且二者的排便功能和对小肠运动的影响在实验检测的各项指标上差异不显著；与番泻叶浸剂相比，除小肠炭末推进率外，其他检测指标均差异不显著。综上，为了避免长期使用番泻叶出现副作用，综合考虑通便效果与身体健康等因素，优先考虑无副作用的高剂量低聚果糖和低剂量乳酸杆菌制剂。

本实验通过对比分析受试药物对便秘大鼠的生长发育、排便功能、小肠运动和肠道菌群等方面的影响，证实低聚果糖和乳酸杆菌均具有润肠通便的作用并对维持肠道菌群平衡、抑制肠球菌和肠杆菌的生长有较好功效，其通便功用大小与药物剂量浓度有关，其中低聚果糖和乳酸杆菌分别于1.0g/(kg·d)和2.0×108CFU/(kg·d)时效果最显著。

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