人血清白蛋白基因的克隆及其真核表达载体构建

洪志勇 李玉芳，2 张兴峰 林秀娇 李鸿翔 庄益芬 张文昌*

（1.福建农林大学动物科学学院 福州 350002；2.黄淮学院 河南驻马店 463000）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是血浆中最丰富的蛋白质成分，约占血浆总蛋白的60%。在体内人血清白蛋白主要起着维持渗透压、保证液体在血管中流动、递送重要生化物质以及作为高容量储库稳定体内游离配基的浓度。由于它在输血、补液、治疗发烧、外伤休克、抗利尿水肿等临床应用上的显著疗效，HSA 在国内外都有很大的市场需求。据近年报道，目前HSA 全球年销售量高达600 t左右，按目前50 美元／10g 计，每年销售额在30 亿美元以上。HSA 在全球的需求量呈上升态势，近年来我国白蛋白需求量每年以49.2%的速度上升。然而市售HSA 主要从捐血者血浆或人胎盘中提取。但近年来越来越多的人因输入血制品HSA 而感染了艾滋病、肝炎等传染性疾病。血源病毒污染，加之国家对血制品严格控制进口，致使HSA 供应十分紧张，人们迫切期望开发新的来源。为缓解这些矛盾，通过基因工程技术把人血清白蛋白基因克隆到微生物、动物生物反应器上进行高效表达是最具有前景的方法。HSA 基因全长16 916 bp，由14个内含子和15个外显子构成，定位于人4 号染色体的q11-22 区段。目前已在小鼠［1］、乳牛［2］、猪［3］、绵羊等［4-5］系统中表达了重组HSA。

目前，通过转基因技术生产重要的人类药物蛋白的优越性和可行性几乎已达成共识。因此，通过制备禽类输卵管生物反应器生产HSA 将会呈现美好的前景。但是目前要制备禽类输卵管生物反应器高水平表达外源基因，还存在很多困难和问题，严重制约了禽类输卵管生物反应器的产业化发展。因此，构建一个高效真核表达载体，然后采用一定基因导入方法，来制备转基因动物，并使外源基因能在禽类输卵管组织中特异性表达就显得十分重要。

卵清蛋白是蛋清中含量最高的蛋白，它的5’调控成分具有组织特异性，并受到激素的诱导，具有很强的表达活性。试验以流产胎儿肝脏组织为材料提取总RNA，用上游引物ALBF 与下游引物ALBR 进行PCR 扩增，获得编码HSA的基因，并对其进行序列测定与分析。再利用鹌鹑卵清蛋白5’调控区构建HSA 基因能在鹌鹑输卵管乳腺中特异性表达的质粒载体，以期为下一步的细胞转染和将来通过体细胞核移植法制备禽类输卵管生物反应器打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 流产胎儿肝脏组织。

1.2 菌种和质粒 宿主菌DH5a为本室保存；质粒Pov（含有鹌鹑卵清蛋白5’调控区序列）由本实验室提供；载体pIRES2-EGFP 购自Promega 公司；质粒pGEM-T Easy Vector 购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 试剂

人血清蛋白基因克隆：所用引物由上海生物工有限公司合成；DNAMarker、TRIzol 试剂、DEPC 水均购自百泰克公司；RT-PCR 试剂盒ThermoscrioptTM、凝胶回收试剂盒为上海生物工程有限公司产品；质粒抽提试剂盒（Omiga）、限制性内切酶XhoI、T4 连接酶均购自Promega 公司；2×Pfu PCR MasterMix为北京天为时代科技有限公司产品。

人血清白蛋白真核表达载体的构建：T4DNA 连接酶购自Promega 公司；各种限制性内切酶、Long Taq 酶、dNTP、DNAMarker 均购自大连宝生物工程有限公司；凝胶回收试剂盒为上海生物工程有限公司产品，质粒抽提试剂盒（Omiga）购自Promega 公司。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 人血清白蛋白基因的克隆 从GenBank 中查到ALB的cDNA 序列NM_000477，借助计算机引物设计软件，设计了2条引物。引物序列如下（Xho I 酶切位点）。

上游引物：5’-CCGCTCGAG ATGAAGTGGGT AACCTTTATTTC-3’；

下游引物：5’-CCGCTCGAG TTATAAGCCTAA GGCAGCTTGAC-3’。

保护碱基+酶切位点+加同源区，用Trizol 法提取样品总RNA，进行RT-PCR。以人源肝脏cDNA 文库为模板，进行PCR 扩增。

取10μL 以上PCR 产物，加入1μL dNTP，2μL PCR buffer 及1μL 普通PCR Taq 酶，再加适量的水至终体积为20μL。72 ℃反应10 min，使PCR 产物加A 尾。取7μL 反应产物，pGEM-T 载体、T4 DNA 连接酶、10×buffer 各1μL，连接过夜。连接产物转化到E.coli DH5α 感受态细胞中。涂布于LA 平板，37 ℃倒置培养12～16 h，挑选阳性克隆，提取质粒并酶切鉴定。

酶切鉴定呈阳性的菌落均送英骏公司测序，以测序结果来判断ALB 在载体上的连接方向，选择正确连接的质粒进行下一步试验。

1.5 真核表达载体构建为了保证能下一步与含有鹌鹑卵清蛋白5‘序列的质粒载体顺利融合，在引物SE5'端添加限制性内切酶kpnⅠ酶切位点，AE5'端添加限制性内切酶HindⅢ酶切位点，合成引物SE和AE：

SE：5′-CCGGGTACC ATGAAGTGGGTAACCTT TATTTC-3'；

AE：5′-CCGAAGCTTT TTATAAGCCTAAGGCA GCTTGAC-3'。

HESAcDNA 基因的PCR 扩增，kpnⅠ/ HindⅢ双酶切质粒pOV、pHSA，回收产物，用T4 连接酶定向连接并进行酶切鉴定。酶切、回收、连接、鉴定均按说明书进行。

质粒pOV-HSA和pIRES2-EGFP 空载体酶切处理，快速回收酶切产物，然后将两者混合后加入T4 DNA 连接酶连接过夜。连接产物转化DH5a，涂布于LA 平板，培养12～16 h 后挑取单菌落阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定。酶切、回收、连接、提取纯化、鉴定均按说明书进行。

2 结果与分析

2.1 人肝脏组织总RNA 完整性和HSA 基因cDNA的RT-PCR 以人工流产胎儿肝脏组织为材料，提取总RNA，完整性较好，可以用于后续试验，电泳结果见图1。并以RT-PCR 方法扩增出HSA 基因1 800 bp 左右的cDNA，全长与预期大小一致，无干扰，表明是特异性扩增，凝胶电泳结果见图2。

图1 总RNA的甲醛变性电泳

图2 PCR 产物的电泳结果

2.2 pGEM-T-ALB 重组质粒的酶切鉴定 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收RT-PCR 产物目的带，将其与T 载体连接并转化E.coli DH5 a，在含Amp 并预先涂布IPTGIX-Gal的LB 平板上筛选，挑取白斑提取质粒。用kpnⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切鉴定，切下了分别为约3.0 kb、1.8 kb 大小的条带(图3)，前者与载体大小相符，后者与HSA cDNA条带的大小一致，结果与预期相符，这说明HSA cDNA 已成功克隆到T 载体上，获得了阳性重组质粒pTH。

图3 重组质粒酶切图谱

2.3 HSA cDNA 测序 测序结果经BLAST 软件分析，与Genbank 中报道的HSA 基因有97%的同源性。个别碱基缺失，但整个读码框并未改变，保证了最大的读码框。序列分析表明，已成功克隆HSA cDNA 序列，可以用于表达载体的构建。见图4。

图4 改造的HSA cDNA 克隆序列的比较分析

2.4 人血清白蛋白基因的改造 以克隆有HAS cDNA的质粒pHSA为模板，通过特异性引物的扩增，在HAS cDNA的两端添加了kpnⅠ和HandⅢ酶切位点，并与PGEM-T 载体连接后亚克隆，用双酶切鉴定，约产生1 800 bp和3 000 bp的片断，表明改造成功，结果见图5。

2.5 HSA 初级表达载体pH-OV的构建 利用kpnⅠ和HndⅢ酶切pOV和pHE 结果如下：将pHESA切为大小约1.8 kb和3.0 kb的两段，其中小片段为HESA；将pOV 切为两段，其中大片段含有鹌鹑卵清蛋白5'调控成分；并且将重组pH-OV 用kpnⅠ和HndⅢ双酶切得到结果小片段HESA和含有鹌鹑卵清蛋白5'调控成分大片段，和预期结果一致，表明HSAcDNA和鹌鹑卵清蛋白5'调控成分成功的融合，得到HSA 初级表达载体pH-OV。见图6。

图6 初级表达载体PH-OV的构建过程

2.6 人血清白蛋白真核表达构建的结果 利用Xho I/kpnI 双酶切重组质粒PH-OV和载体IRES2-EGFP 结果如下：将重组质粒PH-OV 切为大小两段，其中大片段为仅含有目的基因HESA和鹌鹑卵清蛋白5'调控成分的片段；将IRES2-EGFP 切开后，大片段为含有EGFP 报告基因和kan 抗性基因的片段。利用XhoI 单酶切pEGFP-VH 并以IRES2-pEGFP-VH 做PCR。酶切鉴定和PCR 鉴定后均表明，酶切后实现了定向连接，人血清白蛋白输卵管表达基本构件成功的定向克隆在真核表达载体IRES2-EGFP的多克隆位点区XhoI 之后，鹌鹑卵清蛋白5'调控成分驱动的人血清白蛋白输卵管特异性表达载体IRES2-pEGFP-VH 构建成功，简命名为pEGFP-VH，见图7。

图7 重组质粒pEGFP-VH 构建结果

3 讨论

在研究禽类输卵管生物反应器方面，主要研究禽类卵清蛋白调控区调控机制，通过卵清蛋白的调控成分，来启动外源基因特异的在输卵管上皮细胞的高效分泌表达。Sanders等［6］和Park等［7］把不同长度的卵清蛋白基5’因端调控区构建在报告基因的上游，导入培养的原代输卵管细胞，通过报告基因的表达情况，研究卵清蛋白基因5’端调控区的顺式调控元件和反式作用因子等调控元件，并作出了卵清蛋白调控的大体模型。Haecker等［8］也用同样的方法通过输卵管细胞表达报告基因对卵清蛋白基因5’端调控区的各元件进行了更详细的研究，激素依赖性调控元件(SDRE)和反式调控因子(NRE)被定位且功能进一步明确。在该研究基础上，Ochiai等［9］把1.35 kb 长的卵清蛋白基因5’调控区调控的人促红细胞生成素(hEPO)基因通过电穿孔法导人原代输卵管上皮细胞，探讨了hEPO 基因转录的可能性；宇丽等［10］把1.1 kb的卵清蛋白5’端调控区调控的CAT基因通过脂质体技术，转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞。结果在鸡原代输卵管上皮细胞转染48 h 后检测到了外源基因。郑新民等［11］采用显微注射法，使含有猪血清白蛋白侧翼序列的微小人血清白蛋白基因导入猪的基因组中，生产出转人血清白HSA 基因猪，经PCR和Southern 杂交检测，4 头活仔整合有HSA 基因，其中3 头不同程度表达了人血清白蛋白。在转基因小鼠方面，曹新等［12］所构建的pcDNA3.1-6.7hALBm 表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT-PCR 检测hALBm 基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果表明构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。以上说明无论是输卵管生物反应器还是乳腺生物反应器构建具有较长5’端上游乳蛋白调控区的输卵管（乳腺）特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。

本试验将HAS 目的基因与鹌鹑卵清蛋白5’调控区成功定向连接，为调控人血清白蛋白基因的分泌表达奠定了基础。就表达的载体总的结构看，本实验采用真核表达载体IRES2-EGFP 进行重组载体的构建。IRES2-EGFP 载体自身带有能发出绿色荧光的增强型绿色荧光蛋白报告基因紫外线的激发下发出明亮的绿色荧光，其表达的绿色荧光蛋白可以在荧光显微镜下直接观测，该蛋白还可与其他蛋白在N 及C 端融合表达，其表达均不受影响。增强型绿色荧光蛋白是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其产生的荧光较普通绿色荧光蛋白强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度，无种系依赖性，荧光强度、灵敏度及稳定性强，应用广泛。其序列中还含有CMV 强启动子和SV40 polyA 加尾信号，前者可增强外源基因的表达，后者可增强mRNA的稳定性及转录效率。此外，该载体携带的新霉素抗性基因，提供了抗生素G418 筛选的标志，便于转染细胞的筛选。而且报告基因EGFP的存在使阳性的筛选和纯化变得快速、简便和直观。在上游启动子5'端前有终止密码子，很好地避免了报告基因和目的基因的融合表达，从而保证了将来表达和分泌的人血清白蛋白的生物活性不受影响。

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