高效液相色谱法测定甲磺酸伊马替尼的含量和有关物质

刘 娥

（荆楚理工学院化工与药学院，湖北 荆门448000）

甲磺酸伊马替尼（Imatinib mesylate），商品名格列卫，是瑞士诺华公司研发的一种酪氨酸激酶抑制剂，是第一个以蛋白激酶抑制作用模式发挥信号传感抑制剂作用的上市药物。2001年5月10日获得美国食品与药品管理局（FDA）的批准，用于治疗α－干扰素（Interfereon－alfa）治疗无效的胚细胞危象病期、加速病期或慢性病期的慢性骨髓性白血病患者［1］，并以高效、低毒、针对性强的抗癌靶向性，取得了显著疗效，开启了肿瘤分子靶向治疗的新时代［2］。目前，甲磺酸伊马替尼的合成及其作用机制的研究较多［3－6］，而对于其原料药的质量控制的研究并不多见。作者参照有关物质的测定方法［7－9］，建立了测定甲磺酸伊马替尼的含量和有关物质的HPLC方法。

1 实验

1．1 试剂与仪器

甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

甲磺酸伊马替尼对照品，中国药品生物制品检定所；甲磺酸伊马替尼原料药（20121103、20121105、20121108），自制。

Agilent 1100型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；TU－1901型双光束紫外可见分光光度计；CP－224S型电子分析天平，德国赛多利斯；Milli－Q型超纯水机，美国Millipore公司。

1．2 方法

1．2．1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（150mm×4．6mm，5 μm）；流动相：辛烷磺酸钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55（体积比，下同），流速1．0 mL·min－1，检测波长285nm，柱温30℃。

1．2．2 对照品溶液的制备

精密称取干燥的甲磺酸伊马替尼对照品25．0mg，置于100mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成0．25mg·mL－1的甲磺酸伊马替尼对照品储备液。精密量取1．0mL甲磺酸伊马替尼对照品储备液，加甲醇稀释至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得浓度为2．5μg·mL－1的对照品溶液，备用。

1．2．3 供试品溶液的制备

精密称取干燥的甲磺酸伊马替尼原料药25．0mg，置于100mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成0．25mg·mL－1的甲磺酸伊马替尼供试品储备液。精密量取1．0mL甲磺酸伊马替尼供试品储备液，加甲醇稀释至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得浓度为2．5μg·mL－1的供试品溶液，备用。

2 结果与讨论

2．1 色谱条件的选择

2．1．1 检测波长的选择

称取甲磺酸伊马替尼对照品适量，加甲醇溶解并稀释制成浓度为10μg·mL－1的溶液，经紫外分光光度计扫描，甲磺酸伊马替尼在285nm处有最大吸收，故选取285nm为检测波长。

2．1．2 流动相的选择

实验中分别选取甲醇－乙腈、甲醇－三乙胺、甲醇－磷酸盐缓冲溶液（不同比例）作为流动相，结果发现，采用辛烷磺酸钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55作为流动相，分离效果较好，故采用辛烷磺酸钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55为流动相。

2．2 分离专属性

称取甲磺酸伊马替尼对照品适量，加流动相溶解并配制成浓度为0．1mg·mL－1的溶液。取5mL该溶液各4份，分别加1mol·L－1氢氧化钠溶液、1mol·L－1盐酸溶液、30%过氧化氢溶液各2mL、100℃水浴加热1h，中和后加流动相至10mL，进样，考察降解物的分离性能，色谱图见图1。

图1 破坏性实验的HPLC图谱Fig．1 Chromatograms of stress conditions experiment

由图1可知，各峰分离良好，表明方法的分离专属性好。

2．3 线性关系

分别精密量取1．0mL、2．0mL、3．0mL、4．0mL、5．0mL甲磺酸伊马替尼对照品储备液，加甲醇稀释至10mL容量瓶中，定量，摇匀。分别取以上溶液各10 μL进样测定，以峰面积（y）为纵坐标、浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，拟合得回归方程y＝1542．2x＋2．216，R＝0．9999，结果表明浓度在2．5～12．5μg·mL－1范围内与峰面积线性关系良好。

2．4 检测限

精密量取甲磺酸伊马替尼对照品溶液加甲醇稀释制成一系列浓度溶液，取10μL注入液相色谱仪，当主成分峰高为最大噪音峰高的3倍时，进样量即为检测限，结果为0．5ng。

2．5 精密度

在相同色谱条件下，精密量取浓度为2．5μg·mL－1的甲磺酸伊马替尼对照品溶液10μL，连续进样5次，测定峰面积为3782．6、3779．9、3788．5、3781．2、3789．7，平均峰面积为3784．38，方法的RSD（n＝5）为0．11%，表明方法的精密度良好。

2．6 稳定性

在相同色谱条件下，精密量取同一批号浓度为2．5 μg·mL－1的甲磺酸伊马替尼供试品溶液10μL，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h进样，测定峰面积为3768．5、3782．1、3779．6、3780．2、3772．3、3765．4，平均峰面积为3774．68，方法的 RSD（n＝6）为0．18%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2．7 重复性

在相同的色谱条件下，精密量取同一批号浓度为2．5μg·mL－1的甲磺酸伊马替尼供试品溶液10μL，进样，平行测定6次，RSD为0．68%（n＝6），表明方法的重复性良好。

2．8 加样回收率

精密量取浓度为0．25mg·mL－1的甲磺酸伊马替尼对照品储备液1mL、2mL、3mL各2份，分别精密加入原料药粉末约0．5mg，按1．2．3方法制备供试品溶液，取10μL进样测定，结果见表1。

表1 回收率实验结果Tab．1 Results of recovery rate experiment

由表1可知，方法的平均回收率为99．85%（n＝6）。

2．9 原料药的测定

精密称取3批甲磺酸伊马替尼原料药25mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀；分别精密量取1．0mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液10μL，进样测定，记录色谱图。另取甲磺酸伊马替尼对照品25mg，同法进行测定，结果见表2。

3 结论

建立了测定甲磺酸伊马替尼原料药含量和有关物质的HPLC方法。确定色谱条件为：Diamonsil C18色谱柱（4．6mm×150mm，5μm），柱温30℃，流动相：辛烷磺酸钠和磷酸二氢钾的缓冲溶液（pH值3．0）∶甲醇＝45∶55，流速1．0mL·min－1，检测波长285 nm。结果表明，甲磺酸伊马替尼浓度在2．5～12．5μg·mL－1范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率为99．85%（n＝6）。该方法操作简便、快速、灵敏、准确，样品处理容易，可用于甲磺酸伊马替尼的含量和有关物质的检测。

表2 原料药中甲磺酸伊马替尼含量和有关物质的测定结果／%Tab．2 Determination results of content and related substances of imatinib mesylate／%

［1］陈敖，黄荷香，宋帅娟，等．甲磺酸伊马替尼的合成［J］．精细与专用化学品，2007，15（8）：23－25．

［2］宋耕，轩菡，王年飞，等．甲磺酸伊马替尼的临床应用研究［J］．中华临床医师杂志，2011，5（24）：7348－7350．

［3］李铭东，李东，吉民．甲磺酸伊马替尼的合成［J］．中国药学杂志，2008，43（3）：228－229．

［4］陈灵娟，周和平，黄文峰，等．甲磺酸伊马替尼的合成［J］．河北科技大学学报，2011，32（5）：492－495．

［5］Manley P W，Breitenstein W，Brüggen J，et al．Urea derivatives of STI571as inhibitors of Bcr－Abl and PDGFR kinases［J］．Bioorg Med Chem Lett，2004，14（23）：5793－5797．

［6］Wojciech S，Wojciech L，Lukasz K，et al．A process for preparation of imatinib base［P］．WO 2006 071 130，2006－11－16．

［7］刘海燕，崔艳，严拯宇．HPLC法测定盐酸羟嗪含量及有关物质［J］．海峡药学，2009，21（12）：59－61．

［8］杜宁，周艳丽．HPLC法测定那格列奈含量及有关物质［J］．江苏药学与临床研究，2006，14（4）：238－240．

［9］王棋，宋锐，费梦莹，等．梯度洗脱HPLC法测定甲磺酸伊马替尼含量及有关物质［J］．海峡药学，2012，24（3）：58－60．