胡桃醌诱导细胞凋亡机制的研究进展

那文婷，李博雅，韩景春，吴亚猛，杨 森，李 洪，陈飞儿综述，张 巍*审阅 (吉林医药学院:.临床医学院，.基础医学院，吉林 吉林 303)

胡桃醌(juglone，nuein)是存在于胡桃科胡桃属植物胡桃楸和核桃中的小分子萘醌，又名5-羟基-1，4-奈醌;5-羟基-1，4-奈二酮。胡桃醌天然存在于胡桃属植物和胡桃皮中，人工提取出来常为橙黄色或红黄色针状结晶，性质不稳定，温度、pH以及光照都可以使其降解。其熔点为155℃，微溶于热水，易溶于氯仿和苯，溶于乙醇和乙醚。是胡桃楸中主要的毒性物质。

1 胡桃醌诱导细胞凋亡的研究背景

细胞凋亡的概念是由澳大利亚科学家John.F.H.Kerr等人于1972年首次提出的。细胞凋亡是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种自主有序的死亡过程。它不是病理条件下的自体损伤现象，而是一个主动的过程，其中涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用过程，其目的是为更好的适应而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡通路受阻是导致癌细胞产生抗药性的主要原因，细胞凋亡可能通过不同的途径被启动，因此诱导细胞凋亡是大多数抗肿瘤治疗的主要机制［1-2］。

在中国民间，胡桃楸皮作为抗癌验方历史悠久。胡桃醌的抗癌活性研究在国内外均有报道，但目前关于胡桃醌诱导肿瘤细胞凋亡的细胞信号调控机制尚不明确，已有报道的结论不甚一致。在胡桃醌对人肝癌BEL-7402细胞增殖和膜流动性的影响研究中［3］，一定浓度的胡桃醌作用于BEL-7402细胞4 h后线粒体膜电势降低，提示细胞已经开始凋亡级联反应。胡桃醌有效抑制了BEL-7402细胞增殖，发挥作用的机制可能是通过加快细胞膜流动性，促进胡桃醌进入细胞本身，诱导细胞凋亡。曹军等学者研究［4］，胡桃醌有抑制细胞体外生长作用并能阻滞胰腺癌细胞周期诱导细胞凋亡。在对人结肠癌HCT-15、小鼠腹水型肝癌和自发型胃癌的研究中均已证明胡桃醌有明显的抗癌活性［5］。胡桃醌能有效抑制人源肿瘤细胞增殖，且细胞株类型不同，敏感性不同［6］。有学者发现［7］，胡桃醌可以封闭人外周血淋巴细胞的钾离子通道，而钾离子通道保持活性被认为是细胞生长和T细胞增殖的先决条件，因此他们认为胡桃醌的这一作用即使不是唯一的，也是胡桃醌诱导细胞凋亡的重要方式。此外，对胡桃醌的研究发现，胡桃醌对肿瘤细胞DNA合成有明显的抑制作用，其主要抑制细胞生长的S期。通过电子显微镜观察胡桃醌可以影响细胞线粒体，低浓度可使线粒体嵴减少，高浓度可使细胞质中的线粒体空泡化，使肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制［8-10］，从而达到抑瘤作用。

2 胡桃醌对部分凋亡相关基因表达的影响与调控

2.1 对Pin1表达的抑制

肽酰-脯氨酰顺反异构酶(peptidy1-prolylcis/trans isomerase，Pin1)作为一种在磷酸化蛋白水平特异调节的变构酶，在多数肿瘤细胞中，包括最常见的宫颈癌、前列腺癌、脑瘤、肺癌、乳腺癌及黑色素瘤均呈过度表达［11］，而过度表达是肿瘤发生和发展的一个重要标志。分子生物学研究表明，其过度表达与其他癌信号传导途径的基因和蛋白密切相关。Pin1可通过多个信号传导途径，上调细胞周期蛋白D1的表达。作为重要的细胞增殖与分化的调控蛋白，Pin1整合了多个癌信号传导途径，并接受各途径传来的致癌信息并放大，它在致癌信号传导通路中发挥着不可缺少的翻译和放大作用。因此，通过多条途径促进细胞的异常增殖和肿瘤的发生，阻止Pin1的功能或减少其表达将能有效地抑制这些致癌途径。天然产物胡桃醌是通过高通量筛选发现的第一个Pin1小分子抑制剂［12］。胡桃醌是Pin1的不可逆抑制剂，Pin1催化域中Cys113游离的SH-与胡桃醌发生Michael加成，导致结合腔部分打开，从而抑制了Pin1的活性［13］。此外，李玲等学者研究［14］显示，胡桃醌可以通过抑制Pin1表达从而抑制食管癌细胞的增殖，诱导癌细胞凋亡发生，并将食管癌细胞周期阻滞于G2/M期。Pin1小分子抑制剂的研究还处于起步阶段，特异性小分子抑制剂不仅是分子生物学研究的重要工具，也是研制新型抗癌药物的新途径。这些结果可能为抗肿瘤治疗提供了又一新的途径，因而胡桃醌有望成为继传统化疗药物之后的又一新型化疗药物。

2.2 对Bcl-2/Bax蛋白的表达的影响

Bcl-2家族蛋白是细胞生存和死亡信号至关重要的整合因子，存在于线粒体外膜、核膜和内质网膜上，分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类。其中Bcl-2蛋白是家族蛋白中的重要典型抗凋亡蛋白成员。而Bax是典型的促凋亡蛋白。目前的研究认为，Bcl-2家族蛋白可能主要是通过调节线粒体或内质网等细胞内膜结构的通透性，改变与细胞生理功能密切相关的离子或蛋白质因子在细胞内的分布，从而影响细胞的生存和死亡。Bax是BCL-2家族蛋白中研究比较深入的，也是最具有代表性的可在生理条件下形成孔道的促凋亡蛋白。在促凋亡因素的刺激下Bcl-2/Bax的比值将决定细胞的死活。国内学者研究表明［15-16］，随着胡桃醌剂量的增加，Bcl-2蛋白的表达呈剂量依赖性的下降趋势，而Bax蛋白含量呈剂量依赖性的上升趋势，Bcl-2/Bax两者的比例呈下降的趋势。由此可见，胡桃醌可以通过下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达来诱导细胞凋亡。

2.3 对p53基因表达抑制

P53是现在研究非常广泛的抑癌蛋白之一。P53蛋白在细胞生长以及肿瘤调控方面起着重要作用，其分为野生型和突出型。在细胞受到DNA损伤信号后，启动p53基因，使细胞进入G1期生长抑制。活化的P53可以激活多种编码蛋白基因发挥抑制肿瘤的作用［17］。Michelle等报道，胡桃醌能够降低p53基因表达和诱导h2ax快速磷酸化使细胞凋亡，原因可能是胡桃醌通过快速磷酸化细胞周期的各个阶段的h2ax，并且使P53蛋白水平剧烈下降，从而诱导细胞DNA损伤，诱发细胞凋亡［10］。

2.4 对Caspase蛋白表达的影响

细胞的凋亡是一个主动的过程，与许多基因的表达、激活和调控有关。多种蛋白酶参与凋亡信号的传导。最近的研究表明，胡桃醌可以通过细胞特异性Caspase依赖的信号途径诱导凋亡，Caspase酶系在此过程中有重要作用。其中caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应中的“核心”蛋白酶，在凋亡信号传导的许多途径中起着非常重要的作用［18］。在胡桃醌对宫颈癌Hela细胞的细胞毒作用研究中显示［19］，不同浓度的胡桃醌可使caspase-3的活性增强，且具有剂量依赖性。有学者研究［20］，利用分光光度法检测胡桃醌对Caspase活性的影响，结果表明，caspase活性呈剂量依赖性:从时间上来看，在24 h时caspase的活性达到最高。即在24 h时细胞凋亡达到高峰，胡桃醌诱导的细胞凋亡应该为早期凋亡。作用机理为:降解细胞结构，促使细胞形态学变化，包括DNA片段化及凋亡小体的形成。而且随着胡桃醌浓度的增加，Caspase激活力度不断加大。激活后，随即开始其对细胞凋亡程序的启动，开始降解细胞，并且还对线粒体内部的活性氧自由基和ATP造成影响，促进细胞凋亡。

除上述几种诱导细胞凋亡途径外，Maruo［21］等研究证明，胡桃醌能通过抑制DNA复制聚合酶活性抑制人结肠癌细胞HCT116增殖。Xu等［22］发现胡桃醌作用于HL-60细胞后出现一系列凋亡，包括:细胞内线粒体膜蛋白的丢失，细胞色素C、Smac和凋亡诱导因子释放到细胞质中，及胡桃醌诱导凋亡作用可被caspase-9抑制剂阻滞，研究表明胡桃醌诱导细胞凋亡多是通过线粒体凋亡通路。

3 结语

胡桃醌具有广泛的药理作用，在医学和农业上都具有潜在的应用价值。现研究已经证明，胡桃醌具有明确的抗癌活性。但其诱导细胞凋亡的机制并未完全清晰。如今肿瘤治疗高度发达，在以放疗化疗为主的治疗中，西药有着很好的疗效，同时也存在着巨大的副作用。中药具有多靶点、多效应、不易产生耐药性、不良反应小、安全有效等优点，在某种程度上可以弥补西药的不足。中药胡桃醌作为抗肿瘤活性单体仍然存在很大的研究空间，仍然需要科研工作者更加深入的研究其机制和毒性作用。在以后的研究中，可以将胡桃醌与现有广谱治疗药联合探讨其作用机制的同时也将中西药结合，既为中药胡桃醌的临床应用提供了依据，又对中西药结合治疗肿瘤的可能性提供了理论和实验依据。

综上所述，可以得到胡桃醌诱导肿瘤细胞凋亡的机制，而本文只是对上述几种因素在部分文献中出现的相互关系进行归纳，胡桃醌诱导细胞凋亡机制在其他文献中会出现另外的影响因素，尚未达成一致结论，所以这就需要我们进一步的研究新的凋亡分子和凋亡信号，从而研发新型的高效低毒的抗肿瘤药物。

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