CD59在小鼠脑缺血再灌注损伤中的表达及意义

赵 军，晏沐阳，张传福，刘丽霞，宋宏彬

1解放军总医院 心血管病研究所，北京 100853；2军事医学科学院 疾病预防控制所，北京 100071；3解放军第261医院，北京 100094

CD59是补体系统中重要的补体调节蛋白，在补体激活终末阶段抑制攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)的形成，保护细胞免遭补体激活造成的损伤[1]。但其在脑缺血-再灌注损伤中的表达和意义并不清楚。我们通过建立小鼠脑缺血再灌注动物模型，应用免疫荧光组织化学法和荧光定量PCR技术，检测脑组织中不同时间点补体调节蛋白CD59的表达变化情况，初步探讨其在脑缺血-再灌注免疫损伤中的可能意义。

材料和方法

1 材料 健康雄性昆明小鼠48只，体质量(23±3) g，由军事医学科学院实验动物中心提供。随机分为正常组、缺血再灌注6 h、24 h、48 h、72 h、96 h，每组8只。

2 脑缺血-再灌注动物模型建立 参考Longa等[2]的方法并做适当改变，制备小鼠脑缺血再灌注动物模型。用1%戊巴比妥钠按照50 mg/kg腹腔注射麻醉。在小鼠颈部做正中切口，长度约为1 cm，逐步分离小鼠右侧颈总动脉、颈外动脉并结扎。在颈总动脉结扎部位远心端剪口，将直径约为0.125 cm的鱼线插入，进线长度为1~1.5 cm，通过右侧颈内动脉到达右侧大脑中动脉起始处。1 h后拔出，引起再灌注。

3 神经功能缺失评分 按照Longa评分标准的5分法稍加改进进行评分：0分无神经缺损征；1分提尾时左前肢内收，不能完全伸直；2分行走向左倾倒；3分向左旋转；4分不能自己行走或昏迷。1~4分为有效模型[3]。

4 脑组织损伤病理检查 脑组织多聚甲醛固定，蔗糖脱水后行冰冻切片，厚6 μm。切片丙酮4 ℃固定30 s，后稍水洗；苏木素染液染色3 min，1%盐酸酒精分化10 s，水洗2 s；促蓝液返蓝10 s，自来水流水冲洗1 min；0.5%伊红染液染色2 min，自来水冲洗；80%酒精、95%酒精、无水乙醇梯度脱水各1 min，二甲苯Ⅰ1 min，二甲苯Ⅱ1 min，中性树胶封片，显微镜观察拍照。

5 荧光定量RT-PCR检测 NReasy Mini Kit提取脑组织mRNA，逆转录成cDNA后，用下列引物扩增，CD59：上游 5'-TTCTgTTCCACAgCTgTTAgCC-3'，下游5'-TgATTgTTTCCAACACCTTTgA-3'，使用GAPDH作为内参基因：上游5'-TgCCCCCATgTTTgTgATg-3'，下游5'-TgTggTCATgAgCCCTTCC-3'。

6 免疫荧光检测 按实验选取的时间点处死小鼠取材，脑组织多聚甲醛固定，蔗糖脱水后行冰冻切片，厚6 μm。切片置丙酮中4 ℃固定10 min；用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。封闭：10%正常羊血清溶液，37 ℃封闭1 h，甩去封闭液后加一抗 CD46(Santa Cruz Bio-technology)，1∶100(PBS稀释)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；Cy3标记的二抗，1∶50(PBS稀释，避光)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；DAPI染核，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察拍照，并用Image-pro plus6.1图像分析软件进行分析。

7 统计学处理 使用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量资料比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 神经功能缺失评分 与对照组相比，小鼠神经功能缺失评分随缺血-再灌注时间的延长逐渐增高，至24 h达最高(P＜0.01)，至再灌注48 h(P＜0.01)时保持较高水平，72 h后逐渐恢复。见图1。

2 脑组织损伤区组织形态学观察 HE染色后，光镜下观察神经细胞组织形态学变化，发现正常组脑神经细胞结构完整，细胞核较大，细胞及间质无水肿，伴随再灌注时间推进，海马区脑神经细胞多数神经细胞核固缩，神经细胞坏死，伴有水肿，24 h达损伤高峰，72 h以后海马区组织形态有所恢复。见图2。

3 脑组织中CD59 mRNA的表达变化 与空白对照组相比，随着缺血-再灌注时间的延长CD59 mRNA的表达量逐渐减少，24 h最低(P＜0.01)，48 h后逐渐升高(P＜0.01)。见图3。

4 海马区CD59蛋白的表达变化 正常对照组海马区及周围可见大量CD59蛋白沉积,从缺血-再灌注6 h开始，在海马区及周围表达量逐渐减少，24 h最低，48 h后逐渐接近正常。见图4。

讨 论

脑血管病中缺血性脑血管病占80%以上，以其高发病率、高致残率和高病死率严重威胁人类生命健康，早期的溶栓治疗和保护神经是治疗缺血性脑血管病的主要治疗方法，但溶栓药物有严重的并发症，如出血、缺血-再灌注引起的脑水肿和病变血管再闭塞等问题[4-5]。

近年来研究证明，补体激活在脑缺血-再灌注炎症损伤中扮演着重要角色[6-8]。补体调节蛋白CD59通过结合C8、C9，调节C5b-9复合物的形成和功能,防止攻膜复合物MAC对同种或自身细胞的溶解破坏。有研究证实，在猫ALI和ARDS模型中CD59表达下调，在人类罕见疾病如阵发性睡眠性血红蛋白尿中，CD59的表达缺失与血栓形成风险的增加有密切关系[9-10]。

我们通过免疫组化及荧光定量PCR的方法观察了CD59的表达规律，结果发现，正常小鼠脑组织中CD59大量表达，在缺血-再灌注后6 h缺血区神经元及胶质细胞胞浆中CD59表达已开始明显减少，缺血-再灌注后24 h表达最低，持续至48 h，72 h后表达逐渐升高。比较补体调节蛋白CD59的表达变化情况与脑组织损伤的相关性，发现它与脑组织损伤程度呈平行关系。表明缺血-再灌注后CD59的表达变化与脑组织损伤直接相关，是脑组织的保护因素之一。目前有研究证实，作为重要的补体调节蛋白SCR1对大鼠脑缺血再灌注损伤有确切的保护作用，下一步，可以通过检测SCR1在小鼠脑缺血-再灌注不同时间的表达变化，与CD59的表达进行对比，进一步阐释CD59的表达将有助于减轻脑组织损伤，从而为脑保护治疗提供新的思路[11]。

图1 脑缺血再灌注各组神经行为学评分(n=8/组) (与正常组比较，a: P＜0.01)Fig.1 Neurological score of different ischemia-reperfusion groups(n=8)

图2 各组脑缺血再灌注损伤区病理观察(×10)A： 正常对照组； B：缺血-再灌注6 h组； C：缺血-再灌注24 h；D：缺血-再灌注48 h组； E：缺血-再灌注72 h组； F：缺血-再灌注96 h组Fig.2 Pathological injury in control group (A) and ischemiareperfusion groups at 6 h(B), 24 h(C), 48 h(D), 72 h(E) and 96 h(F)(×10)

图3 脑缺血再灌注后各组CD59 mRNA的表达变化(a: P＜0.01； b: P＜0.05 vs control)Fig.3 CD59mRNA expressions in different groups after cerebral ischemia-reperfusion

图4 各组脑缺血再灌注损伤区CD59免疫荧光表达变化(×10)A：正常对照组； B：缺血再灌注6 h组； C：缺血再灌注24 h组；D：缺血再灌注48 h组； E：缺血再灌注72 h组； F：缺血再灌注96 h组Fig.4 Immunofluorescence staining showing CD59 expression in control group (A) and ischemia-reperfusion groups at 6 h(B),24 h(C), 48 h(D), 72 h(E) and 96 h(F)(×10)

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9 杨康，刘维永.猫创伤性ALI和ARDS中CD59和CD46的表达和意义［J］.第四军医大学学报，2000， 21（5）：624-626.

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11 Li S， Xian J， He L， et al. The protective effect of SCR（15-18） on cerebral ischemia-reperfusion injury［J］. Neurol Res， 2011， 33（8）：866-874.