复方丹参滴丸降低尿酸和内皮保护作用动物实验研究

柳 高，朱 平

解放军总医院 南楼心血管一科，北京 100853

复方丹参滴丸在临床的应用日益广泛，研究显示该药对冠心病心绞痛、高血压左室肥厚、高血脂、肾功能不全等多种疾病均有治疗作用。本研究在建立高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)动物模型的基础上，观察复方丹参滴丸降低血清尿酸(uric acid，UA)水平和保护血管内皮的效果，并和传统降尿酸药物别嘌呤醇进行比较，以求拓展复方丹参滴丸的临床应用领域，为降尿酸治疗开辟新的路径。

材料和方法

1 实验药物与试剂 酵母膏(北京奥博星生物技术责任有限公司，货号01-014)；别嘌呤醇片(重庆科瑞制药有限公司)；盐酸乙胺丁醇片(四川天台山制药有限公司)；复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司)；UA试剂盒、NO试剂盒(均为北京方宝生物科技有限公司产品)；兔来源抗小鼠、大鼠、人NF-κBp65(A)抗体，兔来源抗小鼠、大鼠、人VCAM-1(H-276)抗体(均为北京中杉金桥生物医学技术有限公司提供的Santa-Cruz公司产品，工作浓度1∶100~1∶1 000)。

2 实验动物及分组 38只SPF级健康雄性昆明小鼠，饲养于本院动物实验中心，体质量(38.43±3.81) g。随机分为3组，对照组12只，别嘌呤醇组和复方丹参滴丸组各13只。

3 给药剂量和方法 对照组(A组)：酵母膏15 g/(kg·d)+乙胺丁醇12.5 mg/(kg·d)+适量蒸馏水；别嘌呤醇组(B组)：(酵母膏和乙胺丁醇剂量同上)+别嘌呤醇20 mg/(kg·d)；复方丹参滴丸组(C组)：(酵母膏和乙胺丁醇剂量同上)+复方丹参滴丸11.57 mg/(kg·d)。给药容量：0.8 ml/只，1次/d，连续灌胃给药3周。

4 血液标本收集及检测 给药3周后各组小鼠依次用乙醚充分麻醉，摘眼球取血。血液标本按照分组放入4 ℃冰箱冷藏静置24 h后，在台式高速低温离心机10 ℃、3 000 r/min条件下离心5 min。将血清移至EP管中，-20 ℃冰箱分组冷冻保存。使用小鼠血清UA和血清NO酶联免疫分析(ELISA)试剂盒分别测定各组血清UA和血清NO水平。

5 主动脉标本NF-κB和VCAM-1检测 将取血后的小鼠仰卧固定在操作台上，眼科剪沿左右两侧腋前线剪开胸腔，剪去肺脏，充分暴露心脏。注射器抽取2 ml 10% PBS甲醛溶液由心尖处注入，从主动脉弓处开始分离截取主动脉约2~2.5 cm，同时取下心脏，将主动脉及心脏标本立即放入含有10% PBS甲醛溶液的试管中浸泡固定，经石蜡包埋、切片后进行HE染色，并进行免疫组化检测NF-κB和VCAM-1的蛋白表达(DAB试剂盒ZLI-9017和SP免疫组织化学染色试剂盒PV-6000：美国Invitrogen公司生产，中杉金桥生物医学技术有限公司代理)。

6 主动脉形态学观察 使用OLYMPUS BX60显微镜，在400倍视野下重点观察各组主动脉结构的改变和内膜NF-κB、VCAM-1表达的强弱。

7 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。定量数据用表示；多组间均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 各组血清UA、NO水平比较 试验中小鼠均未出现意外死亡。别嘌呤醇组和复方丹参滴丸组血清UA和NO水平与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.01)，提示二者均能显著降低血清UA水平，并提升血清NO水平；复方丹参滴丸组与别嘌呤醇组血清UA和NO水平差异也存在显著统计学意义(P＜0.01)，提示复方丹参滴丸降低UA和提升NO的作用更加明显，见表1。

表1 实验结束后各组小鼠血清UA、NO水平比较Tab.1 UA and NO level of each group after the trial

2 主动脉标本HE染色 各组主动脉内膜形态和血管壁结构均未发生改变，见图1。

3 主动脉内膜NF-κB蛋白表达 对照组主动脉内膜NF-κB可见连续阳性表达，别嘌呤醇组和复方丹参滴丸组表达均有减弱，复方丹参滴丸组减弱更加明显，见图2。

4 主动脉内膜VCAM-1蛋白表达 对照组主动脉内膜VCAM-1可见连续阳性表达，别嘌呤醇组和复方丹参滴丸组表达均有减弱，复方丹参滴丸组减弱更加明显，见图3。

讨 论

早期研究提示丹参的有效成分丹参酮ⅡA具有抑制黄嘌呤氧化酶(XO)活性的作用，而XO是体内UA合成的关键酶，对于UA的生成意义重大[1]。张霞、吴慧也发现长时间服用治疗剂量复方丹参滴丸对XO的活性具有抑制作用[2-3]。本研究中复方丹参滴丸组小鼠血清UA水平与对照组相比下降明显，证实了复方丹参滴丸具有降低UA的作用，其机制考虑与抑制XO活性，减少了UA的产生有关。

研究提示血清UA水平和血清同型半胱氨酸(Hcy)水平存在正相关，Malinow认为其可能机制是由S-腺苷-同型半胱氨酸产生的腺苷，优先掺入UA的前体池，将Hcy和UA的合成相关联[4-5]。二者均通过抑制NO产生、增强过氧化物反应和炎性反应等途径，造成血管内皮损伤[6-7]。Liang等[8]研究显示，中药制剂通心络胶囊能够上调内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表达、激活PI-3K/Akt/HIF依赖的信号途径，增加NO释放，从而改善血管内皮功能，减轻高同型半胱氨酸血症(HHcy)对血管内皮的损伤，而复方丹参滴丸和通心络胶囊在制药配方上有相同之处。药理研究还证明，复方丹参滴丸能清除氧自由基、减少脂质过氧化物、降低血脂，抑制炎症反应，同时其有效成分丹参素可直接通过调节血管内皮细胞ET-1 mRNA的表达水平，控制ET产生与分泌，提高血中NO浓度，保护血管内皮功能，提示复方丹参滴丸具有直接升高血NO的效果[9]。本研究中复方丹参滴丸引起血清NO水平升高，除上述直接原因外，可能还与UA水平降低后继而引起Hcy水平下降、或者直接降低Hcy水平有关。动物实验发现丹参的活性成分之一咖啡酸(caffeic acid，又名3，4-二羟基肉桂酸)具有抑制HHcy加速的小鼠脑静脉中白细胞滚动和黏附作用，提示其可能成为针对HHcy的治疗新策略[10]。但是复方丹参滴丸是否具有降低Hcy的作用及其具体机制，仍有待进一步阐明。

图1 小鼠主动脉标本HE染色(×400)(箭头所指为主动脉内膜)A：对照组； B：别嘌呤醇组； C：复方丹参滴丸组Fig.1 HE staining of mouse aorta specimen(×400)(arrow indicates aortic endomembrane)A: control group; B: allopurinol group; C: The Compound Danshen Dripping Pill group

图2 小鼠主动脉内膜NF-κB蛋白表达(×400)(箭头所指为主动脉内膜)A：对照组； B：别嘌呤醇组； C：复方丹参滴丸组Fig.2 Expression of NF-κB protein in mouse aortic endomembrane(×400)(arrow indicates aortic endomembrane)A: control group; B: allopurinol group; C: The Compound Danshen Dripping Pill group

NF-κB作为早期转录因子，调控参与早期免疫反应和炎症反应各阶段的许多分子，其表达程度可以直观地反映动脉血管内皮出现炎性反应和损伤的程度。VCAM-1是内皮细胞损伤或活化的标志物，在内皮细胞受损或活化的情况下表达将会明显增加。本研究的免疫组化结果提示别嘌呤醇和复方丹参滴丸均对血管内皮具有保护作用，而且复方丹参滴丸的保护作用更加显著。

总之，本研究通过短期动物实验，初步验证了复方丹参滴丸具有降低血清UA和保护血管内皮的作用。今后随着对复方丹参滴丸药理作用认识的不断深入，我们在HUA患者中也将开展长期的临床相关研究，其结果可能在目前传统降UA药物不良反应多、疗效不佳，且新型降UA药物比较匮乏的大环境下，为临床降UA和血管保护治疗提供一条崭新的途径。

1 张海德，黄玉林，何继芹.丹参二萜醌对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2007，21（3）：174-178.

2 张霞．复方丹参滴丸对人体黄嘌呤氧化酶活性的影响［J］.中国医院药学杂志，2009，29（19）：1622-1624．

3 吴慧，张霞．复方丹参滴丸对药物代谢酶CYP1A2，NAT2和XO活性影响的研究［J］.中国现代应用药学，2009，26（1）：8-11．

4 郭存九，朱爱萍，黄淑田，等．应用受试者特性曲线分析血清胆红素尿酸和同型半胱氨酸对冠心病诊断的临床价值［J］.中国药物与临床，2009，9（1）：26-29．

5 Malinow MR， Levenson J， Giral P， et al. Role of blood pressure， uric acid， and hemorheological parameters on plasma homocyst（e）ine concentration［J］. Atherosclerosis， 1995， 114（2）： 175-183.

6 Leyva F， Anker S， Swan JW， et al. Serum uric acid as an index of impaired oxidative metabolism in chronic heart failure［J］. Eur Heart J， 1997， 18（5）： 858-865.

7 王枚，李霞．高同型半胱氨酸血症与心脑血管疾病关系的研究进展［J］．医学综述，2010，16（22）：3444-3447．

8 Liang JQ， Wu K， Jia ZH， et al. Chinese medicine Tongxinluo modulates vascular endothelial function by inducing eNOS expression via the PI-3K/Akt/HIF-dependent signaling pathway［J］. J Ethnopharmacol， 2011， 133（2）： 517-523.

9 赵然尊， 樊启财， 刘志江， 等. 复方丹参滴丸对冠心病合并2型糖尿病患者ET、NO的影响［J］.山东医药， 2009， 49（1）：110.

10 程丝，冯娟，王宪．高同型半胱氨酸血症治疗研究进展［J］.生理科学进展，2011，42（5）：329-334．