磷酸二酯酶抑制剂对糖尿病大鼠抗氧化作用的实验研究

于海英，焦金菊

辽宁医学院 生理学教研室，辽宁锦州 121000

糖尿病晚期患者多数伴有多器官并发症，成为致死的主要因素。研究表明氧化应激在糖尿病及其并发症的发生和发展中起到重要作用，临床和实验研究证实氧化应激及抗氧化能力减弱是糖尿病并发症的主要病因[1]。应用抗氧化治疗可逆转氧化应激对组织的损伤，从而阻止或延缓糖尿病及其并发症的发生、发展。磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesterase inhibitors，PDEIs)临床主要用于治疗呼吸道痉挛、舒张血管平滑肌、增强心肌收缩力等[2]。最近有报道称PDEIs具有抗氧化作用[3]。本实验应用米力农，昔多芬，茶碱3种PDEIs治疗由链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病模型，探讨3种PDEIs对糖尿病大鼠氧化应激的影响及保护作用，为糖尿病及其并发症的药物治疗提供新的思路。

材料和方法

1 实验动物与试剂 健康成年SD(sprague dawley)雄性大鼠30只，体质量180~220 g，辽宁医学院动物中心提供。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)为Sigma公司产品；米力农为山东新时代药业有限公司产品；茶碱为湖北武汉药业有限公司产品；昔多芬为嘉兴宜博生物医药科技有限公司出品；丙二醛、总抗氧化能力检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。血糖检测仪为美国强生公司onetouch。

2 糖尿病大鼠模型建立 将实验大鼠适应性喂养1周，给予12 h -12 h光照-黑暗周期(6：00 ~18：00)。造模组腹腔注射链脲佐菌素40 mg/kg，(STZ溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液中，pH值为4.4)，对照组腹腔注射等量0.1 mol/L枸橼酸缓冲液，36 h后由尾静脉取血测空腹血糖，血糖＞16.7 mmol/L且稳定即可确认糖尿病。造模过程中约有20%的死亡率，死亡的动物由新动物造模补充。

3 实验分组 实验分5组，即非糖尿病对照组(未注射STZ)，将已成模的糖尿病大鼠随机再分成4组，每组6只：糖尿病对照组；PIDEs组分别为米力农组给予米力农3.17 mg/(kg·d)，茶碱组给予茶碱 100 mg/(kg·d)，昔多芬组给予昔多芬 1 mg/(kg·d)。两个对照组给予相同量的0.9%氯化钠注射液，连续15 d灌胃给药。15 d后所有大鼠先取血液样本，然后被处死。

4 血糖、体重测定 大鼠在治疗前及治疗后5 d、10 d和15 d称体重，并尾静脉抽取静脉血滴在试纸上，采用血糖仪(onetouch)自动读取数值，记录。

5 丙二醛检测 将采集的血液样本用肝素钠抗凝，1 000 r/min离心10 min。收集上层血浆采用丙二醛(malondualdenyde，MDA)试剂盒进行检测。过氧化脂质降解产物中的MDA与硫代巴比妥酸结合，形成红色产物，测在532 nm处最大吸收峰值。

6 总抗氧化能力测定 TAOC测定采用TAOC试剂盒用铁还原法进行测定[3]。

结 果

1 血糖、体重检测 造模后大鼠活动减少，精神萎靡。非糖尿病对照组血浆葡萄糖(5.1~5.4) mmol/L，实验大鼠经STZ诱导后血糖可达(21.8±0.8) mmol/L，表明糖尿病大鼠模型制备成功。三种PDEIs治疗组血糖水平与糖尿病对照组治疗前后比较血糖水平无明显变化(表1)，说明PDEIs对于血糖无影响。而从体重方面看，非糖尿病组体重随时间推移逐渐增加，其他组动物体重随着时间推移逐渐下降，各治疗组动物体重下降情况与糖尿病模型组并无统计学差异(表1)，因而PDEIs也无调节体重作用。

2 体内氧化应激水平 非糖尿病对照组大鼠的TAOC和MDA与糖尿病对照组大鼠比较有统计学意义(P＜0.01，表2)。三种磷酸二酯酶抑制剂都显著降低了血浆MDA水平，同时提高了TAOC水平(P＜0.01)，且对于TAOC的水平提高能力为米力农＞昔多芬＞茶碱，表2。

表1 各组动物体质量，血糖值(n=6，

表1 各组动物体质量，血糖值(n=6，

aP＜0.01，与NDM组比较，bP＜0.05

?

表2 血浆MDA, TAOC测量值(n=6，μmol/L)

表2 血浆MDA, TAOC测量值(n=6，μmol/L)

P＜0.01，与DM组比较

?

讨 论

糖尿病发病机制复杂，主要表现为糖代谢紊乱，后期常常出现多个器官的并发症而给患者带来严重后果。目前糖尿病并发症的致病原因中，体内氧化应激水平升高是公认的损伤机制。一些报道认为抗氧化酶活性的减少导致了TAOC降低，如超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶[4]。临床上抗氧化应激的药物有多种，如天然抗氧化剂维生素C，E等，但是研究报道这些药物并不能减少糖尿病并发症的发生率[5]。以往PDEIs主要作为强心、血管舒张、平滑肌舒张、抗哮喘、抗抑郁等药应用[6]。PDEIs的药理作用主要是增加细胞内环磷酸腺苷(cydic adenosine monophosphate，cAMP)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平并促进组织释放NO[7]。最近研究报道PDEIs有提高机体抗氧化的能力，本实验分别选取米力农(3型PDEIs)、茶碱(4型PDEIs)、昔多芬(5型PDEIs)治疗糖尿病大鼠，在一定程度上降低了血浆MDA水平同时提高了总抗氧化能力。米力农的抗氧化能力要比昔多芬和茶碱强，能显著引起总抗氧化能力的提高并减少氧化应激。这表明PDEIs由于抗氧化应激效应而对糖尿病具有保护性作用。研究表明氧化应激引起的生物学反应与脂质过氧化物产物有关，能诱发包括G蛋白、cAMP、cGMP、蛋白激酶C、MAP级联等多种致病的细胞内信号发生，最终导致细胞功能障碍[8]。而我们发现PDEIs在抗氧化应激方面发挥着重要作用，可以对抗并逆转由STZ诱导的糖尿病大鼠血浆氧化应激水平。

实验中发现PDEIs对于动物的血糖和体重无调节作用，这说明其对糖尿病大鼠的保护作用不是通过降低葡萄糖浓度实现的。Bhatia等[9]报道NO在血管内皮细胞通过cGMP和cAMP协同作用发挥抗氧化作用。他们认为cAMP介导的NO保护内皮细胞损伤的机制是通过cGMP依赖抑制cAMP分解实现的。此外还有报道NO能保护肺成纤维细胞、血管内皮细胞、人神经母细胞瘤细胞和腮腺免受氧化应激引起的细胞损伤[10]。因此应用PDEIs增加了环化核苷酸能够对抗氧化应激引起的细胞功能障碍和细胞凋亡。关于cAMP和cGMP磷酸二酯酶保护作用的确切机制还需要进一步研究[11]。

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