RP-HPLC法测定解肌宁嗽丸中甘草苷、葛根素、柚皮苷、橙皮苷

王 坤， 谢强胜

(山东省食品药品检验所，山东济南 250101)

解肌宁嗽丸一方来源于《沈氏尊生书》宁嗽汤加减，后收录在《北京市中药成方选集》，主治相同。现行标准为《中国药典》2010年版一部［1］。现行标准中定量测定是以柚皮苷为指标［1-2］，测定枳壳中柚皮苷［3-4］。本实验参考相关报道［10-12］，建立了同时测定解肌宁嗽丸中有效成分橙皮苷［5-6］、柚皮苷［7］、葛根素、甘草苷［8-9］的定量测定，试验结果表明，该方法可用于解肌宁嗽丸的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters2695-2996液相色谱仪;METTLER AE240电子天平 (瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药 甘草苷 (批号111610-200401)、葛根素 (批号110752-200209)、柚皮苷 (批号110722-200309)、橙皮苷 (批号110721-200211)对照品均购自于中国药品生物制品检定所;甲醇 (分析纯、色谱纯);解肌宁嗽丸 (天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂)，为大蜜丸。

2 实验方法

2.1 色谱条件 Diamonsil ODS C18色谱柱 (250 mm×4.5 mm，5 μm);流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液 (25∶75);体积流量1.0 mL/min;检测波长283 nm;柱温为35℃;进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取甘草苷、葛根素、柚皮苷、橙皮苷10.05 mg、12.75 mg、20.30 mg、20.40 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取2、2、3、3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，制成20.1、25.5、60.9、61.2 μg/mL混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取重量差异项下的本品，剪碎，混匀，取约2 g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声处理 (功率300 W，频率40 kHz)45 min，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液用微孔滤膜 (0.45 μm)滤过，即得。

2.4 阴性溶液的制备 取不加甘草、葛根、枳壳、陈皮的空白样品按照供试品溶液的制备项下的方法，制成溶液，即得。

2.5 系统适用性及专属性试验 分别精密吸取上述对照品混合溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定，测定结果见图1。4种成分分离度均大于2.0。理论板数以4个目标成分计均不低于3 000。阴性样品在4个目标成分的色谱峰位置上无干扰，表明专属性好。

3 实验结果

3.1 线性关系考察 精密吸取上述对照品混合溶液4、8、12、16、20 μL，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，对照品的量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。结果显示在相应进样量范围内，4个成分线性良好，结果见表1。

3.2 精密度试验 精密吸取上述对照品混合溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积积分值。计算得甘草苷RSD为1.08%，葛根素RSD为0.75%，柚皮苷RSD为1.18%，橙皮苷RSD为0.34%。试验结果显示仪器精密度良好。

图1 混合对照品 (A)、供试品 (B)和阴性对照 (C)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixture standard substances(A)，sample(B)and negative sample(C)

表1 4个成分线性测定结果Tab.1 Linearity of four components

3.3 重复性试验 依2.3项供试品溶液的制备方法制备，按照样品测定方法，对同一批号样品进行6次平行试验，计算质量分数，结果显示，甘草苷平均质量分数为0.36 mg/g，RSD为1.56%;葛根素质量分数为0.25 mg/g;RSD为1.74%;柚皮苷质量分数为1.41 mg/g，RSD为1.18%;橙皮苷质量分数为1.72 mg/g，RSD为1.22%。

3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，每隔2 h进样一次，每次10 μL，共考察12 h，以观察样品溶液在检测过程中待测成分的稳定性。计算得甘草苷RSD为1.47%，葛根素RSD为0.36%，柚皮苷RSD为1.19%，橙皮苷RSD为0.87%%。说明供试品溶液在12 h内稳定。

3.5 加样回收试验 精密称取3.3项下已测定的重量差异项下的样品6份，每份约1.0 g，分别置50 mL量瓶中，精密加入甘草苷对照品溶液 (0.58 mg/mL)、葛根素对照品溶液 (0.21 mg/mL)，柚皮苷对照品溶液 (1.60 mg/mL)，橙皮苷对照品溶液 (1.90 mg/mL)混合对照品1 mL，加入50%甲醇至刻度，超声处理 (功率300 W，频率40 kHz)45 min，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。按2.1项下测定方法进行测定，分别计算回收率，结果表明本法具有良好的回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

3.6 样品的测定 按2.3项下的方法制成供试品溶液，精密量取上述混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按2.1项下方法进行测定4个成分，按外标法计算，结果见表3。

4 讨论

4.1 色谱条件的优化 原《中国药典》甘草、葛根、枳壳、陈皮项下流动相为甲醇-水、乙腈-水、甲醇－0.1%磷酸水溶液，从色谱结果看，甲醇－0.1%磷酸水溶液为流动相测定时理论板数及拖尾因子结果最理想，加入酸有利于减少拖尾，故最终确定以甲醇－0.1%磷酸水溶液为流动相。

4.2 吸收波长的选择 为了保证被测组分具有适宜灵敏度和精密度，本课题组测定了橙皮苷、柚皮苷、葛根素、甘草苷在流动相中紫外吸收光谱，甘草苷在277 nm有最大吸收;葛根素在250 nm处有最大吸收，柚皮苷［11］和橙皮苷在283 nm处有最大吸收。经过研究确定283 nm为本实验的吸收波长。在283 nm条件下，建立以上定量测定方法，该方法稳定可靠。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:1194.

［2］沈金鳌.沈氏尊生书［M］.北京.中国中医药出版社，1997:254.

［3］郭朝晖，魏舒畅，欧阳晓玫.HPLC法测定增食颗粒中柚皮苷和橙皮苷的含量［J］.中国中医药信息杂志，2008，15(7)49-50.

［4］金 艺，张红霞，许海燕，等.高效液相色谱法测定胃力片中柚皮苷和橙皮苷的含量［J］.中南药学，2008，6(3):317-319.

［5］唐德智.通宣理肺胶囊中柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(15):93-95.

［6］袁 杰，于江泳.HPLC法测定健脾丸 (浓缩丸)中柚皮苷和橙皮苷［J］.中成药，2011，33(6):992-994.

［7］黄美声，沈玉刚.反相高效液相色谱法测定化橘红中柚皮苷的含量［J］.中草药，1990，21(5):15-18.

［8］王静竹，陈定一.高效液相法测陈皮中橙皮甙的含量［J］.中国中药杂志，1994，19(7):424-425.

［9］伍蔚萍，阎宏涛，孙文基.HPLC法测定甘草中甘草苷的含量测定［J］.药物分析杂志，2004，24(4):425-427.

［10］陈永刚，林 励，魏燕华，等.超声波提取法与索氏提取法提取化橘红柚皮苷的比较研究［J］.中药新药与临床药理，2008，19(4):309-311.

［11］袁旭江，林 励，陈志霞.化橘红中柚皮苷元的含量特点探讨［J］.广州中医药大学学报，2004，21(5):391-394.

［12］姜舜尧.HPLC法测定2种含陈皮中成药中的橙皮苷含量［J］.中成药，2001，23(8):68-70.