周围神经显微结构的拉曼光谱和超光谱成像特征

徐沁同 陈增淦 张键 周建平 张峰 陈统一 姚文华 李庆利 刘洪英 张人

(1.复旦大学附属中山医院骨科，上海 200032;2.复旦大学分析测试中心，上海 200433;3.华东师范大学极化材料与器件实验室，上海 200241)

周围神经中的神经纤维显微结构历来是研究热点之一。过去对于周围神经纤维的显微结构研究大多注重于组织化学染色、免疫荧光方法等，对神经的物理学性质认识较少，其实，物质的物理学特性最容易直接地被识别。

随着光学技术的不断进步和成熟，光谱在医学领域中的应用越发受到重视。拉曼光谱(Raman spectroscopy)能够给出物质的深层次信息，最初应用于有机化学和材料分析。而超光谱成像具有实时、快速、不破坏细胞、敏感性高、分辨率高、能够定性定量等优势。目前，已经确认，显微拉曼光谱可以区分同种组织的肿瘤细胞［1-3］、干细胞［4-5］、炎性反应［6］以及不同组织的细胞［7］等。超光谱成像技术能同时提供生物组织样本图像和光谱两方面的信息，能对检测标本进行定性、定量和定位的描述，是具有潜力的新兴成像和检测技术［8］。目前，超光谱成像技术已被应用于医学领域，如生物组织的血色素检测［9］，糖尿病足［10］、糖尿病的视网膜病变［11］以及各种肿瘤［12-15］的诊断随访，中医舌诊［16］等。

本文应用显微拉曼光谱和分子超光谱成像对周围神经的显微结构进行研究，旨在为应用光谱技术对周围神经的各种研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 取材 取成年普通级新西兰大白兔10只(体质量约2.5 kg，雌雄不限)，空气静脉注射处死后迅速解剖，显露椎管和硬膜，分离双侧骶1脊神经前根和后根，于神经根起始端1 mm处用弹簧剪刀剪断，剪取5～8 mm标本，置于包埋液中，液氮快速冷冻，于-80℃冰箱贮藏。

1.2 仪器设备与试剂 激光共聚焦显微拉曼光谱仪购自法国HORIBA Jobin Yvon公司(激光波长632.8 nm，功率4.3 mW，激光光斑直径 0.7 μm)，分子超光谱成像系统由华东师范大学极化材料与器件实验室提供，Leica CM1850型冷冻切片机购自德国Leica公司。分子超光谱成像系统的操作方法详见参考文献［11］。

1.3 方法

1.3.1 切片制作 不对标本进行固定处理，于-20℃下直接作横断面冷冻切片，拉曼光谱研究采用30 μm厚度的切片，超光谱成像研究采用10 μm厚度的切片，切片后直接贴片。

1.3.2 拉曼光谱采集和分析 将切片置于高倍光镜(×400)下，随机选取直径超过1 μm的轴突断面，用激光共聚焦显微拉曼光谱仪进行显微拉曼光谱采集，采集时间50 s;光谱采集条件:波数范围400～3600 cm-1。在相同参数下取同一切片空白处的扫描背景作对照。原始数据经LabSpec 3.0人工基线处理和计算机多项式迭代法平滑曲线后获得最终用于数据分析的显微拉曼光谱。

1.3.3 超光谱成像和数据分析 采用分子超光谱成像系统，将切片置于低倍光镜(×20)下，在固定波段+非积分连续采集模式下调至清晰显示后，采集模式设为积分方式+连续采集模式，设置扫描频率178 MHz，频率间隔1 MHz，采集80个波段，保存系统采集样本图像数据，在相同参数下取同一切片空白处扫描的背景作对照。用ENVI(environment for visualizing images)4.7在完成校正的光谱文件中选取一个视野清晰的波段，在神经切片的断面图像上选取轴突中任意一点，圈取感兴趣区域(regions of interest，ROI)，即可获得该区域的平均光谱信号。每个切片标本圈取15个ROI，避开直径小于1 μm的神经纤维，应用环境可视化图像ENVI计算平均光谱曲线。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差()表示，对峰值比值采用t检验和聚类分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 周围神经的显微拉曼光谱

2.1.1 周围神经纤维的拉曼光谱基本特点经过计算机平滑和基线处理后，脊髓前根和后根切片标本均在 550 cm-1、1080 cm-1、1280 cm-1、1440 cm-1、1660 cm-1附近表现出强度明显的拉曼强度，而其中一般以1440 cm-1处的拉曼强度为最高。见图1。

图1 脊髓前根和后根的显微拉曼光谱(×400)

550～660 cm-1属于各种卤代烷类的C-X伸缩;1080 cm-1、1110 cm-1可能为碳水化合物的振动;1440 cm-1为C-H变形振动，属于类脂物质;1280 cm-1和1660 cm-1峰分别起源于由C=O基团和N-H基团所形成的酰胺III和酰胺I谱带，属于蛋白质的吸收峰，反映了蛋白质的含量。2700～3000 cm-1峰为CH伸缩振动，反映了神经纤维中的脂类，而3000～3400 cm-1为镜检时所添加的水溶液媒介引起。2700～3400 cm-1信号在不同标本中的差异很大且缺乏规律表现。选取 550 cm-1、1080 cm-1、1280 cm-1、1440 cm-1、1660 cm-1处的强度(± 15cm-1内取最大强度)进行主成分分析，见各峰值贡献率均较高。见表1。

表1 染色前脊髓前后根拉曼强度主成分分析

在各拉曼强度中I1440数值最大，提示一次合格的神经纤维的显微拉曼光谱采集需要在1440 cm-1处有明显的峰强读数。

2.1.2 运动和感觉神经纤维拉曼光谱的区别 对550 cm-1、1080 cm-1、1280 cm-1、1660 cm-1处与1440 cm-1处拉曼强度的比值分别进行独立样本的t检验，结果差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。根据拉曼强度比值进行聚类分析认为，运动和感觉神经纤维的信号相似，见图2。

表2 染色前脊髓前后根拉曼强度比值

2.2 周围神经的超光谱成像

2.2.1 周围神经断面的超光谱基本特征 根据计算得到的平均曲线分析，运动与感觉纤维轴突的超光谱曲线相似，但髓鞘表现出的信号与轴突截然不同，见图3。

2.2.2 周围神经纤维髓鞘的超光谱成像识别 由于髓鞘信号与轴突信号差异很大，采用光谱角度匹配法(spectral angle mapper，SAM)，可直接将无色的髓鞘和感觉或运动神经纤维的轴突进行区分，并拟就伪彩色图像，从而可以清晰地显示包裹在轴突外的髓鞘，见图4。

图4 SAM处理后拟合生成的伪彩色图像(×20)

3 讨 论

近年来，国内外开始应用显微拉曼光谱对生物学物质分析研究。目前，拉曼光谱大多用于鉴别不同组织学特性的细胞，对不同功能、组织学特征相近细胞的研究则较少见。有研究［17］用光谱识别肿瘤细胞，这是因为肿瘤细胞在增殖过程中，肿瘤细胞内核酸和脂质发生改变而被识别［17］。

显微拉曼光谱对研究周围神经标本具有一定优势。首先，拉曼光谱技术对于被测样品的制备无特殊要求，样品可以是细胞悬液，也可以是经过固定或者经过各种染色的细胞;其次，低能量的激光波长对于待测样品几乎无损伤，并且能够实现对样品的实时检测［18］;第三，水对可见光吸收很弱，因此应用拉曼光谱较红外光谱更适合对需要保持湿润的周围神经标本进行研究，但显微拉曼光谱用于周围神经研究也有不足之处，例如，周围神经纤维相似成分的分子数量远大于特异性蛋白的分子数量，这些特异性分子的拉曼信号常被整体信号掩盖，从而无法在光谱中直接读出。因此，在未作任何处理的原始状态下，最终获得的两种神经纤维的显微拉曼信号之间无显著差异。

本研究未发现两种周围神经纤维的拉曼信号有差异，而各条光谱曲线却又完全不同。根据应用拉曼光谱检测生物标本的经验来看，生物样品的拉曼信号极为复杂，拉曼强度受扫描范围内被测物质密度、结构组成以及杂质等各种因素影响，导致即使同一位置两次测量的光谱信号之间也会存在一定微小偏差。本研究还发现，不同功能的神经切片样品本身的光谱差异同样十分微小，通过细微的信号差异进行组织学上的识别非常困难。如果能对周围神经纤维的拉曼光谱进行一定的修饰，则有可能将运动与感觉神经纤维加以区分。通过髓鞘染色来观察正常和病理情况下髓鞘是否完整，有无变性、坏死及修复情况，对神经组织的病理诊断和研究有实用意义。目前关于髓鞘的研究主要依赖染色方法，大致有以下几种:苏丹黑法［19］、重铬酸钾法［20］、Luxol fast blue法［21］、银染色法［22］等。这些方法普遍存在染色时间长以及缺少对比度和特异性的缺点。同时，在石蜡切片时，髓鞘中的类脂质容易被溶解，其形态特点及成分受到影响，难以显示真实形态。总之，在分子超光谱成像方法问世之前尚无一种简单而又敏感的方法可供基础研究以及临床检测应用［23］。

本研究采用的分子超光谱成像方法对于分析冷冻切片具有很大的优势。首先，应用分子超光谱成像分析髓鞘性质，省去了繁琐的染色过程和昂贵的试剂，直接进行数据分析也较好地维持了生物细胞的原始结构和物质成分。在过去的研究中，分子超光谱成像技术已经展示了其能区分不同种类细胞的优势。轴突是神经元细胞的一部分，其断面包括了细胞质、细胞器以及多种神经因子、神经递质等物质，而包绕其周围的髓鞘则实为神经膜细胞的质膜沿着轴索的轴心螺旋缠绕形成的多层脂双层结构。本研究通过大量取样，获得了典型的髓鞘超光谱曲线，成功应用该特征光谱曲线对神经切片中的髓鞘组织进行了识别，通过计算机处理生成伪彩色图像，比同样将髓鞘显色的染色后光镜镜检方法更为快捷。本研究采用光谱角匹配法对光谱曲线进行区分。光谱角是指具有同样波长范围的2个像元向量在光谱空间上所形成的夹角，它可作为衡量光谱相似性的一个重要指标。2条曲线之间的光谱角越小，其余弦值也接近为1，说明两光谱向量也相似，光谱特性越相近;反之，若光谱角越大，光谱之间的差异越大。本研究在ENVI软件中设定一个角度α，光谱相似性小于此角度者被识别，其余信息都不被识别，由此完成光谱曲线信号的区分;其次，应用分子超光谱成像能够定性、定量地反映髓鞘性质的改变。刘洪英等［11］率先应用分子超光谱成像系统对促红细胞生长素治疗糖尿病视网膜病变进行了定量分析，提示分子超光谱成像系统可以作为一种新的手段对病理及药物疗效进行研究。髓鞘变性和脱髓鞘改变必然也具有各自典型的超光谱特征，通过对它们的进一步研究，可以了解正常髓鞘与病变髓鞘的超光谱曲线变化特点，此举确好地发挥了超光谱成像在病理学、药理学方面快速、可靠、定性、定量的优势。

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