牛奶中庆大霉素半定量胶体金试纸条的研制

北京陆桥技术有限责任公司

王丽哲 王丽丽 赵 瑜于重楠 唐慧林 刘 敏

中国检验检疫科学研究院 何艳玲

庆大霉素属于常见的氨基糖苷类药物之一，在兽医临床中应用广泛，对于奶牛乳房炎、子宫内膜炎的治疗均有很好的疗效（徐亭，2005）。然而，庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重，随着该药的大量使用，其残留检测也渐渐被人们所重视 （李桂平等，2008）。我国及欧盟对庆大霉素的残留有严格要求，在牛奶中的最大残留限量不能高于100 μg/kg。

本研究研发了一种半定量检测牛奶中庆大霉素的胶体金试剂盒，在传统胶体金检测的基础上加以改进，包含有一条控制线（C线），两条不同限量的检测线T1、T2（均包被目标检测物全抗原），用于牛奶样品中目标残留物的半定量检测。

1 材料与方法

1.1 实验材料 氯金酸 ，SIGMA公司；硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫、塑料背衬，均为Millipore公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验仪器 BioJet点膜仪XYZ 3050，BioDot公司；数控斩切机ZQ5000，上海金标生物技术公司；高速低温离心机3K15，SIGMA公司；水浴锅BT-47，YAMATO公司；恒温培养箱Ic160，Sacvis公司；恒温磁力搅拌器HJ-3，金坛市科兴仪器厂；冰箱FF40，海尔公司；冷藏柜MDF-192AT，SANYO公司；涡旋振荡器MS1 Minishaker，IKA公司。

1.3 实验方法

1.3.1 庆大霉素偶联抗原合成 庆大霉素属于小分子抗原，需要与其他蛋白偶联制备成全抗原方具有免疫原性，并需以竞争法制备胶体金试纸条。称取40 mg庆大霉素硫酸盐和10 mg BSA，分别溶解于1 mL的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到庆大霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2 h以上。取120 mg EDC.HCl溶于1 mL蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌1 h以上，然后于4℃放置过夜。用PBS透析3 d后，分装，-20 ℃贮存（徐亭，2005）。

1.3.2 抗体-胶体金标记

1.3.2.1 胶体金溶液的制备 将1 g氯金酸溶于超纯水配制0.01%的氯化金水溶液，取100 mL加热至沸腾，在搅动状态下加入1.5 mL的1%柠檬酸三钠水溶液。继续加热煮沸15 min，随后冷却至室温，用超纯水恢复至原体积，在波长510～550 nm测定其最大吸收波长，并4℃避光保存（付云洁等，2010；邓省亮等，2007）。

1.3.2.2 最适标记pH的确定 取15个1.5 mL试管，分别加入1 mL制备好的胶体金溶液，用0.1 mol/L K2CO3调节 pH 为 3、4、5、6、7、8、9、10，后室温放置10 min；加入浓度为0.2 mg/mL的庆大霉素抗体，每管各60 μL，混合后室温放置30 min；观察胶体金颜色变化，直到室温下放置2 h仍保持红色的为最适pH。

1.3.2.3 最低标记蛋白量的确定 取6个1.5 mL试管，分别加入1 mL制备好的胶体金溶液；用0.1 mol/L K2CO3调节pH为最适pH，混合后室温放置 10 min； 分别加入 10、15、20、25、30、35 μL、0.2 mg/mL庆大霉素抗体，混合后室温放置30 min；每管加入20 μL浓度为10%的NaCl溶液，混合后室温放置10 min；颜色仍保持红色的最小蛋白用量即为最小蛋白标记量。

1.3.2.4 抗体-胶体金复合物制备 取已制备好的胶体金溶液50 mL，用0.1 mol/L K2CO3溶液调pH至最适标记pH。搅拌中加入抗体至最适标记蛋白量，继续搅拌20 min，加入10%BSA水溶液直至BSA的终浓度为1%，继续搅拌10 min；于4℃、12000 r/min离心30 min，小心弃去上清，加入 50 mL 0.01 mol/L Tris-HCl溶液 （pH 8.2，含1%BSA，简称TBS）再重复清洗一次，最后用5 mL 0.01 mol/L TBS将沉淀重悬，0.22 μm微孔滤膜过滤，4℃避光保存。

1.4 免疫层析胶体金试纸条的制备 方法参照许定花等（2009）中的制备方法。

1.4.1 检测线、控制线及抗体-胶体金复合物包被浓度的确定 包被T1、T2两条不同浓度的庆大霉素偶联抗原在硝酸纤维素膜上，作为层析试纸条的检测线；包被二抗（兔抗鼠抗体）在硝酸纤维素膜上作为层析试纸条的控制线，其中控制线包被在两条检测线上方；再包被抗体-胶体金复合物在胶体金结合垫上作为游离反应物，通过对添加庆大霉素标准品的检测结果分析，调整两条检测线的包被浓度，以及抗体-胶体金复合物的包被浓度，使T1、T2两条检测线在检测牛奶样品中庆大霉素时，最终灵敏度分别为20 μg/kg和100 μg/kg。

1.4.2 胶体金试纸条各组分的组装 依次将包被有T1、T2线和C线的硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水垫贴到背衬上，组装成大卡；然后将大卡用斩切机切割成4 mm宽度的试纸条，用于后续实验。

2 结果和分析

2.1 胶体金溶液的制备 所制备的胶体金颜色为红色，透明，在510～550 nm其最大吸收值为1.149，对应的吸收波长为528 nm（图1）。

图1 胶体金溶液最大吸收波长扫描图

2.2 最适pH的确定 经过实验确定的最适标记pH为8。

2.3 最低标记蛋白量的确定 经过实验确定的最小蛋白用量为 25 μL，即 5 μg/mL。

2.4 免疫层析胶体金试纸条的制备 最终确定抗体-胶体金复合物用TBS以 1∶1比例稀释后浓度最合适，将此溶液包被玻璃纤维，37℃恒温干燥箱烘干用于制备免疫层析试纸条。确定的控制线包被浓度为0.3 mg/mL，两条检测线T1、T2包被浓度分别为0.1 mg/mL和0.5 mg/mL。

用组装的免疫胶体金试纸条检测牛奶样品，T1、T2两条检测线的灵敏度可分别达到20 μg/kg和100 μg/kg（图2）。且样品仅需稀释即可上样检测，5 min内即可出结果，方法简便，可实现现场快速检测。

图2 阴性牛奶样品添加庆大霉素标准品 20 μg/kg 和 100 μg/kg 检测结果

3 讨论与小结

目前牛奶中庆大霉素的残留检测常用的方法是液相色谱法、酶联免疫法和免疫胶体金层析法。前两种方法需要专业人员和设备，无法实现现场快速检测，传统的免疫胶体金层析法可以实现样品的现场操作，但只能实现样品残留的定性检测，而无法做到半定量检测（马伟等，2009；齐雪琴，2006）。

本实验通过牛奶样品中的目标残留物与呈横条状分布于免疫层析膜上的 T1、T2线共同竞争性地与胶体金标记抗体反应，由免疫层析膜上T1、T2线的显色情况来判定待检样品中目标残留物的含量范围，当层析膜上的T1、T2均显色时，说明待检测样品中的残留物含量低于最低检测限；当层析膜上T1、T2线只有一条显色，说明待检测样品中残留物的含量在最低检测限和最高检测限之间；当层析膜上T1、T2线均不显色，仅有C线显色时，说明待检测样品中残留物的含量超过了最高检测限。该庆大霉素半定量金标快速检测试剂盒，最低检测限为20 μg/kg，最高检测限为100 μg/kg。设定的最低检测限可以满足企业对于优质奶源分级筛选的要求，最高检测限可以满足我国以及欧盟标准最高残留限量要求。

由此可见，本研究所制备的免疫层析试纸条在检测牛奶样品时，检测方法简单，所需检测时间短，可实现现场快速检测，不仅实现了对样品的定性检测，更能对样品进行半定量检测，对奶制品质量控制方面来说有重大意义。

[1]邓省亮，赖卫华，许杨.胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究[J].食品科学，2007，28（2）：232 ～ 236.

[2]付云洁，刘志国，武玉香，等.胶体金免疫层析法快速检测食品中金霉素残留[J].食品科学，2010，31（2）：191 ～ 194.

[3]李桂平，张海棠，王自良，等.庆大霉素的毒副作用及其残留检测[J].湖北农业科学，2008，47（6）：723 ～ 725.

[4]马伟，汪宝欢，李娟，等.庆大霉素酶联免疫检测法研究[J].食品科学，2009，30（10）：242 ～ 244.

[5]齐雪琴.电化学液相色谱分析庆大霉素的方法 [J].福建分析测试，2006，15（1）：4 ～ 7.

[6]徐亭.庆大霉素单克隆抗体的制备及初步应用：[硕士学位论文][D].扬州：扬州大学，2005.

[7]许定花，刘丽强，郑蓓蓓，等.胶体金免疫层析法参数的优化[J].食品科学，2009，30（20）：155 ～ 159.