复合肝素及CD34抗体可降解镁合金支架在心肌血运重建中的应用

张 嵬，杨 力，刘晓程，张杰民，陈 越，张亚东

(天津医科大学心血管病临床学院、泰达国际心血管病医院，天津 300457)

冠状动脉旁路移植术和经皮冠状动脉介入是当前治疗冠心病的主要手段，但是对于弥漫性病变的患者并不适于用上述的方式重建心肌血运。心肌打孔治疗是终末期冠心病的一种治疗方式，然而人工腔道的闭塞却严重影响了该治疗方式的效果。目前有研究显示，心肌钻孔合并心室支架植入的方法重建缺血心肌血运取得了一定的研究成果［1～3］。2011年11月～2012年6月，我们应用镁合金替代以前应用的聚乳酸/乙醇酸制成新型的可降解心室支架，同时复合肝素及CD34抗体，以期增加支架强度，保持支架通畅，促进腔道内血管内皮细胞生长，从而有效地重建心肌血运。

1 材料与方法

1.1 材料 vWF鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体(Dako公司，丹麦);显微镜摄像系统(BX51，OLYMPUS公司，日本);经图像分析软件Image Pro Plus 6.0(MediaCybernetics，美国);中华实验用小型猪(购自北京琉璃河科兴实验动物养殖中心);麻醉机、心电监护仪(Detax-Ohmeda 700，美国);高速机械打孔器(北京凯迈医疗设备公司)

1.2 方法

1.2.1 猪急性心肌梗死模型及镁合金支架的制备①模型建立:选用中华实验小型猪18只，肌注盐酸赛拉嗪(2 mg/kg)诱导麻醉，然后气管插管，呼吸机辅助通气(潮气量350 mL，呼吸频率15次/min，氧流量1 L/min)。术中吸入1%～2%异氟醚，静脉持续泵入丙泊酚3 mg/(kg·h)维持麻醉，持续进行心电监护。经胸骨正中切口暴露心脏，结扎冠脉前降支中、远端1/3交界处，通过心电图确定心肌梗死模型制作成功。心肌梗死模型制作成功后，将动物随机分为3组(每组6只):A组为对照组，B组为心肌打孔+复合缓释肝素的可降解镁合金支架植入组，C组为心肌打孔+复合缓释肝素和CD34抗体的可降解镁合金支架植入组。在B组和C组中，于心肌梗死区采用自制高速钻孔器(13000 r/min)由心外膜各打两个透壁孔道。每个孔道内植入1枚可降解的管形支架，随即结扎心外膜预留的荷包缝线控制出血并固定支架。术后肌注青霉素300万U，2次/d，连续3 d。②镁合金支架的制备:支架由镁锌合金制成，直径2 mm，厚度0.15 mm，长度10 mm，分别涂覆肝素及CD34抗体。每个镁合金支架复合肝素约500 μg，控释作用可持续6个月左右。镁合金支架的抗压性测试结果显示，支架的径向抗压性能为75 kPa，能满足支架植入心肌的要求。降解时间测试结果显示，镁合金支架体外降解时间1个月以上。

1.2.2 超声心动图检测 图像采集应用GE 33超声心动仪，S3探头频率为1.6～3.2 MHz，同步记录ECG。分别于心尖两腔、四腔、左心室长短轴切面采集资料存盘，脱机测量左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)，计算LVEF=(LVEDV－LVESV)/LVEDV×100%。

1.2.3 核素心肌灌注显像 心肌梗死模型建成后即刻和术后6周时经猪耳缘静脉注射14.8 MBq/kg99mTc—甲氧基异丁基异腈，给药30 min后行心电门控心肌灌注核素显像。仪器为GE Millennium VG-5，配低能通用型准直器，两个探头呈90°夹角，绕心脏旋转180°，每帧采集25 s，共采集30帧，矩阵64×64，放大倍数2.0。采用滤波反投影重建原始图像。通过Emory Cardiac Toolbox软件量化灌注质量缺损百分率(MDP)的变化，其中MDP=(Md/Mt)×100%。Md指灌注缺损部位心肌质量，Mt指整个心肌质量。以每只动物治疗前和治疗后6周时MDP的差值(△MDP)，作为衡量各组血流灌注情况改善的指标。

1.2.4 新生血管密度的量化分析 上述图像采集结束后，静脉注射100 g/L的KCl 10 mL使心脏停搏于舒张期。从孔道周围随机采集组织标本，依次经40 g/L的甲醛固定24 h、脱水、浸蜡、包埋及切片(5 μm)后，常规行HE染色与免疫组织化学染色。后者的主要步骤为:切片以30 ml/L的H2O2阻断，滴加正常羊血清封闭，依次滴加小鼠抗人血管性血友病因子单克隆抗体(4℃过夜)及二抗羊抗小鼠IgG多克隆抗体，加DAB显色后，苏木素复染。在放大倍率、曝光时间均相同的条件下，每组随机采集50个非重叠视野图像，转化为Tiff格式保存，经图像分析软件Image Pro Plus 6.0处理，校正A值后进行量化分析。

1.2.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件，实验数据以表示，组间数据的比较采用单因素方差分析。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 实验动物情况 本实验选用中华小型猪18只建立心肌梗死模型，4只在结扎冠脉后出现室颤，予电除颤后均复律，全组无死亡。支架植入组6周内各脏器均未发现栓塞，提示无支架残余脱落。

2.2 超声心动图检查 心梗模型制作成功后即可见相应部位的局部室壁运动减弱。治疗前各组LVEF无明显差异。术后6周时检查结果显示，C组、B组LVEF分别为(53±2)%、(47±3)%，均高于A组［(43±3)%］，三组差异有统计学意义(P均＜0.05)。

2.3 核素心肌灌注显像测定 治疗6周，B组和C组的△MDP值分别为(－1.43±0.47)%和(－1.47±0.82)%，明显低于 A 组［(2.75 ±0.24)%］，差异有统计学意义(P均＜0.05)。C组的△MDP略低于B组，但差异无统计学意义。A、B、C 3组的短轴核素心肌灌注扫描结果显示，治疗后6周时心肌灌注缺损面积较治疗前明显改善。见图1。

图1 三组治疗前和治疗后6周心肌灌注核素扫描显像垂直短轴图像

2.4 组织学分析 6周后心脏组织学检查见A、B、C 3组的人工腔道基本上完全闭锁，镁合金支架全部被吸收，孔道周围形成少量的瘢痕组织。6周后，通过免疫组织化学方法检测缺血心肌组织中新生血管密度的变化。经图像分析软件量化分析后显示，治疗后6周B组、C组新生血管密度OD值为5381±76和5682±29，较A组(2873±59)明显增加(P均＜0.01)。A组和B组之间没有统计学差异(P＞0.05)。

3 讨论

心肌打孔是有效的心肌再血管化方法之一，其治疗的理论基础是左心室腔内的动脉血可以通过孔道灌注到心肌窦状隙，从而营养与支持心肌细胞［4］。但是目前的研究结果表明，无论激光打孔还是机械打孔，都无法维持孔道的长期开放［5］。本实验所采用的镁合金支架抗压性能好，可以维持腔道处于持续开放状态。此外，支架由可降解的镁合金材料制成，控制肝素与CD34抗体持续缓慢释放，发挥其在局部持续抑制凝血途径的激活和诱导微血管形成及微循环重建的作用。CD34于1984年由美国科学家Civin发现，属于钙黏蛋白家族，其结构包括胞外区、跨膜区、胞质区3部分［6］。CD34是内皮祖细胞上的一个相对特异的表面抗原，参与了内皮祖细胞的定位与黏附。抗CD34抗体能够特异识别细胞，并通过抗原抗体结合原理从外周血中募集内皮祖细胞。Rotmans等［7］证实在血管材料上预置CD34抗体可通过抗原抗体反应的原理捕获循环中的内皮祖细胞，而内皮祖细胞在一定条件下可进一步分化成内皮细胞。此外，美国Orbus Medical Technologies公司所研制成功的Genous生物工程R支架就是在不锈钢冠脉支架上涂覆一层含有CD34抗体的基质成分。研究证实，该种支架可促进内膜损伤处的修复和支架表面的早期内皮化，并取得了较好的短期临床效果。我们将CD34抗体复合到支架上使其在短期内发挥捕获循环中内皮祖细胞的优势，促进内皮祖细胞种植并加速细胞分化，在人工腔道内生长出内皮细胞。

本实验发现，在治疗后6周支架全部吸收，未见残余及脏器栓塞，证实了镁合金支架的安全性。但是，支架所形成的人工腔道为纤维组织所填充，未见明显的血管内皮细胞生长，人工腔道完全闭锁。因此，本实验研究并没有达到预期的目的，缺血心肌内没有形成被覆内皮细胞的人工腔道。上述结果说明，镁合金支架内虽含有缓释肝素，却没有抑制腔道内血栓的形成，考虑此与人工腔道直径偏小、无法抑制内外源凝血机制有关。再者，CD+34细胞仅占骨髓单核细胞的1.5%，在外周血中的比例低于0.5%，内皮祖细胞数量太低以致于无法发挥其效应。综合考虑上述可能造成腔道闭锁的原因可为今后支架的改进提供思路。首先，增加支架的内径至3 mm或以上;其次，利用一些能够影响外周血中内皮祖细胞浓度的细胞因子或药物，如GM-CSF、G-CSF、促红细胞生成素、血管内皮生长因子和他汀类药物等促进内皮祖细胞的动员，增加被捕捉细胞的数量，从而促进腔道的内皮化［8］。

本实验还发现，复合肝素和CD34抗体的可降解镁合金支架植入心肌梗死区后，能够显著增加缺血心肌的新生血管密度，增加缺血部位心肌的灌注，进而改善心脏的功能，说明可降解镁合金支架植入对急性心肌梗死具有积极的治疗作用。

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